Способ регенерации растений люцерны

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических Республик(51)М. Кп аявки 89 рисоединением 1 Н 3 Гос рственныи комитеСССРлам изобретенийи открытийДата опубликования описания 30,068 Ав зобретения А.В,Мезенце(71) Заявител Всесоюзный ордена Трудового Красного Знамени научноисследовательский институт кормов им. В,Р.Вильямса 4). СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИИ ЛЮЦЕРН идиз олог и ции рас в неизв аопи 20 среду ввоа вмг/лгфю тл лРОЛТУЙ Изобретение относится к сельскму хозяйству и может быть испольэвано в селекции и семеноводстве,частности для соматической гибрции, в исследованиях по фитопатфизиологии и генетике растений,Известны спссобы получения изолированных протопластов люцерны имезофилла и, кончиков корней путемвоздействия целлюлолитическими ипектолитическими ферментами в расворе осмотиков (1 .Однако способы регенераний люцерны из протонластостны. Известны также способы регенерации растении из изолированных протоПластов табака, моркови, картофеля и некоторых других культур 21.Однако эти способы оказались неприемлемыми для люцерны, что связано со специфическими требованиями данной культуры к питательным средам и условиям инкубации.Известен также способ регенераци растений люцерны из каллусов листового происхождения на агаризованных питательных средах ) 3.Однако этот способ оказался неиз протопластов люцерны, так каккаллусы и протопласты имеют существенные различия в отношении питательных сред и условий инкубации,способствующих образованию регенерантов.Целью изобретения является получение регенерантов иэ протопластовдля последующей генетической модификации растенийПоставленная цель достигаетсятем, что иэ каллусов листового проИсхождения выделяют протопласты иинкубируют в жидкой питательной среде Гамборга В- с фитогормонами 1824 ч в темноте, а затем 5-7 недельпри освещенности 400-600 лк с еженедельным добавлением свежей питательной среды без осмотика до обрзования многоклеточных колоний, кторые переносят на агаризованнуютательную среду Гамборга В с фи 5тогормонами, и после образованияиз них каллусов последние пересаживают на среды, способствующие регенерации растений,Причем в жидкую питательнуюГамборга В в качестве осмотикадят 85000-95000 мг/л О-маннита,идатва йитотлвмонов. 1.0-1.5,2500150 134 250 15028 37 МикроэлементыМп 504 НО802 п 504 7 Нп 0йа 1 Иоо2 НОС ибод, 5 Н 0СоС 1 , 6 Н 0К 3 1032025О 0250025075 40 ВитаминыНикотиновая кислота 1Тиамкн НС 1 10Пиридоксин НС 1Мкоиноуит 100Сахароза 20000Материал инкубируют 3 недели при непрерывном освещении люминесцентными лампами (освещенность 0,5- 4,0 тыс.лк), температуре 26+1 С и относительной влажности воздуха 95- 1000 в закрытых прозрачных сосудах.В случае появления на листочках бактериальной или грибной инфекции их удаляют с частью прилегающей к ним питательной среды, вирусная инфекция устраняется под воздействием фитогормонов.Развившиеся каллусы переносят в раствор ферментов с осмотиком, содер жащий, вес.3: . 2,4-0, 0,5-0,75 мг/л кинетина и 0,2- 0,8 мг/л бензиламинопурина, а н агаризонанную среду Гамборга Вб н качестве фитогормонов вводят 0,6- 1,0 мг/л бензиламинопурина и С,З,5 мг/л индолил-уксусной кислотыСпособ осуществляют следующим образом,Листочки, то есть пластинки тройчатого листа культивируемых сортов и гибридов люцерны стерилизуют в 0,1-ном водном растворе диоцида к после трехкратной промынки в стерильной дистиллированной воде делают на каждом из них ряд надрезов по всей площади пластинки и помещают на основную питательную среду Гамбор га В (О ОавЬога еГ а 1. Ехрегищепса 1 се 1 йеьеагсЬ, 50, 1, с, 151- 158, 1968), в которую дополнительно вводят б 000-8000 мг/л бактоагара и 200-300 мг/л нктрата аммония, со- Щц держание сахарозы увеличивают до 25000-35000 мг/л и вносят следующие фитогормоны, мг/л: 2,4-0 дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-0) 8-16, кинетин 6-10 иск -нафтилуксусная кислота (НУК) 0,1-0,5. рН среды доводят до 5,8-6,0.Состав среды Гамборга Вб (рН 5,5) представлен ниже, мг/л:Освещенность,лк; О, (темнота) Образование колоний и развиткекаллусовНе образуются Целлюлоза 4,0 - 5,0Пекткназа 2,0-2,5Хлористык кальций СаС 1 бН О 5,0-5,5ВодаВ этом растворе каллусы дс бит дообразования однородной суспензкк кзатем инкубируют в темноте г. температуре 26+1 С в течение 14-16 ч.Выделившиеся протопласты отделяют отгрубых примесей путем фильтрованиячерез двухслойную капроновую сеткус диаметром отверстий 125 мкм, а затем отделяют от раствора ферментовчетырехкратным центрифугиронанием(135-160 9), используя для промывки5,0 - 5,5%-ный раствор хлористогокальция (СаС 1 6 Н 0).После центрифугиронания и удаления супернатанта (недостаточная жидкость) к изолированным протопластамдобавляют жидкую среду Гамборга Б-,содержание сахарозы в которой увеличивают до 25000 - 35000 лг/л, дополни -тельно вводят ос,лотик 0-маннит(85000-95000 мг/л) к фитсгормоны,мг/л: 2,4-0 1-1 ккнетин 0,5-0,75и бензкламинопурин (БЛП) 0,2-0,8,рН среды доводят до 6,0,Изолированные поотопласты инкубируют в закрытых прозрачных сосудах18-24 ч в темноте, а затем при непрерывном люминесцентном освещенки(400 в 6 лк) при температуре 26.-1 оСи относительнои злажности воздуха95 в 10 и добавляют в течение кнкубации (5-7 недель) через каждуюнеделю 10-15 вес,% снежей питательной среды того же состава, но безО-маннита, 2,4 - 0 и кинетина.После образования из протопластон клеточных колоний (более 32 клеток в каждой) кх переносят на средуГамборга В 5, в которую вводят бактоагар 8000-10000 мг/л, содержаниесахарозы увеличи:вают до 2500035000 мг/л и добавляют 0,6-1,0 мг/лБАП и 0,3-0,5 мг/л индолкл - 3-уксус -ной кислоты (ИУК) и инкубкруют притех же условиях, но освещенностьувеличивают до 3000-4000 лк.Изолированные протопласты люцерны после выделения инкубируют втемноте 18-24 ч, так как на светубольшая часть протопластов повреждается. При выдержинаник протопластон в темноте больше 24 ч замедляется темп клеточных делений. Образование колоний из протопластов и каллусов из колоний происходит тольков условиях оптимальной освещенности.Ниже приведены результаты влиянияосвещенности на образование многоклеточных колонии из протопластови развитие каллусовиз колоний, 743647100-300 400-600 700-1500 2000-2500 3000-4000 5000-10000 40 45 П р и м е р, Проводилась регенерация растений из протопластов, выделенных из каллусов листового происхождения, гибридной люцерны сортов Рамблер и Зайкевича и желтой сорта Дединовская. При этом были получены следующие результаты: 90 листочков, помещенных на питательную среду с тремя фитогормонами, образовали каллусы. Последние помещали в раствор ферментов с осмотиком, содержащий вес,%: целлюлоза ОпогцМар 1500 4,0 пектиназа Вегаса 2,0, хлористый каль ций (СаС 1 6 НпО) 5,5 и вода 88,5. 55 Не образуютсяКолонии образуютсяв течение 5-7 недель, каллусы необразуютсяКолонии образуютсяв течение 5-7 недель, каллусы образуются в течение5-6 недель.Колонии не образуются, каллусы образуются в течение4-5 недельКолонии не образуются, каллусы образуются в течение2-3 недельНе образуются Таким образом, оптимальная освещенность при инкубации протопластов до момента образования многоклеточных колоний колеблется в пределах 400- .1500 лк, однако с целью экономии электроэнергии используют освещенность 400-600 лк. Быстрое образование каллусов из многоклеточных колоний (через 2-3 недели ) наблюдается при освещенности 3000-4000 лк, уменьшение освещенности значительно замедляет процесс каллусогенеза. Образовавшиеся из клеточных колоний каллусы переносят на среду тогоже состава, которая применялась дляполучения каллусов из листочков иинкубируют в течение 2-3 недель, азатем разросшиеся каллусы переносятна среду Гамборга В, в которую вводят 6000-8000 мг/л бактоагара, содержание сахарозы увеличивают до25000-35000 мг/л и добавляют 0,20,8 мг/л БАП.Образовавшиеся на каллусах зеленые эмбриоиды 1 соматические зародыши)переносят на среду того же составабез фитогормонов, Условия инкубацииостаются прежними, но длину фотопериода.сокращают до 16 ч в сутки. Помере развития растений на этой среде и появления у них двух-трех тройчатых листьев и корней их пересаживают в почву и выращиьают в обычных условиях. О 15 20 25 30 З 5 Раствор стерилизовали фильтрованием через стеклянный фильтр 305 (5 сЬойс апс 1 Сеп, 1 епа, ООВ). По 2 мл раствора заливали в чашки Петри (60 к 12 мм) и помещали туда по 1 каллусу, затем дробили его шпателем до образования однородной суспензии и инкубировали в течение 14-16 ч в темноте при температуре 26+10 С, Выделившиеся протопласты отделяли отгрубых примесей путем фильтрования через двухслойную капроновую сетку с диаметром отверстий 125 мкм. Изолированные протопласты отделяли от раствора ферментов четырехкратным центрифугированием (150 9), используя для промывки 5,5-ный растворхлористого кальция (СаС 16 НО), затем добавляли к оставшимся в осадке протопластам жидкую среду Гамборга В с О -маннитом и тремя фитогормонами и высевали в чашки Петри (по 2 мл на чашку Петри 60-12 мл) . Финальная концентрация протопластов составляла 40000-60000 в 1 мл.Через 5-6 недель из протопластов образовались клеточные колонии (более 32 клеток в каждой), которые после 2-3 недель инкубации на агаризованной среде Гамборга В 6 с 0,8 мг/л БАП и 0,4 мг/л ИУК образовывали небольшие каллусы (в среднем масса одного каллуса 200 мг). Последние инкубировали 2-3 недели на среде того же состава, которая применялась для получения каллусов из листочков, а затем помещали их на среду с 0,2 мг/л БАП,ЧеРез 2-3 недели на каждом к лусе образовалось в среднем 2 зеленых эмбриоида, которые пересаживали на среду Гамборга В без фитогормонов, По мере развития из эмбриоидов растений с двумя-тремя тройчатыми листьями и корнями их пересаживали в почву и выращивали в обычныхусловиях, где они цвели и образовали семена.Использование изобретения позвог.яет ускорить получение новых сортов и гибридов люцерны за счет трансформации (введения молекул ДНК в.протопласты и регенерации измененных растений), соматической гибридизации путем слияния изолированных протопластов и получения высокопродуктивных, устойчивых к неблагоприятным факторам среды, болезням и вредителям межвидовых и межродовых гибридов,трансгеноза - переноса генетическойинформации в изолированные протопласты с помощью бактерий и вирусов, генетической инженерии и конструирования гибридов, в которых сочетаются органеллы, ядра и цитоплазма, полученные из различных форм растений.Регенерация растений люцерны из протопластов открывает большие воз743647 Формула изобретения Составитель Г. БростюкРедактор Е.Месропова Техред Е. Гаврилещко Корректор Г.Назарова Заказ 4532/18 Тираж 700 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 1130 35, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. ужгород, ул. Проектная, 4 можности для изучения тонких механизмов цитодифференцировкн, взаимодействия с патогенами и т,д. 1. Способ регенерации растений люцерны, включающий получение каллусов на агариэованной питательной среде и последующее культивирование их в условиях, способствующих образованию иэ них растений, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью получения регенерантов из протопластов для последующей генетической модификации растений, из каллусов листового происхождения выделяют прото- пласты и инкубируют в жидкой питательной среде Гамборга В 6 с фитогормонами 18-24 ч в темноте, а затем 5-7 недель при освещенности 400- 600 лк с еженедельным добавлением свежей питательной среды без осмотика до образования многоклеточных колоний, которые переносят на агариэованную питательную среду Гамборга Эу с фитогормонами, и после образования из них каллусов последни пересаживают на среды, способствующиерегенерации растений.2. Способ по п,1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в жидкую питательную среду Гамборга В 6 в качествеосмотика вводят 85000-95000 мг/л0-маннита, а в качестве фитогормонов 1,0-1,5 мг/л 2,4-0, 0;5-0,75 мг/лкинетина и 0,2-0,8 мг/л бенэиламинопурина.3. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в агаризованнуюсреду Гамборга В 6 в качестве фитогормонов вводят 0,6-1,0 мг/л бенэиламинопурина и 0,3-0,5 мг/л индолил 15 -3-уксусной кислоты.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. "Селекция и семеноводство",1977, Р 1, с. 35-37.29 2, 3, Та 1 еЬе, Т. На 9 ага. "Р госора 5 сеь е Гоэоп се сецеь ворай- циеэ чееазаеэ, Р 212, р, 175-188,Рагэ, 1973.3. Авторское свидетельство СССРР 679190, кл, А 01 Н 3/00, 1977 (прототип),