Способ получения противоракового препарата

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 1790410 19/ .Ыи 3. ОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ТЕНТУ а 1, СЬегп 1 са 1 о,1988, т,36, М ослеп)зажгу апб р. 361-365,РОТИВОРАКО биология. Сущет культивирос)цгпдепз з. ожение молекул(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПВОГО ПРЕПАРАТА(57) Использование: микроность изобретения: включавание штамма Вас 11 цзподготовку культуры и разл Изобретение относится к микробиологии, а именно к способу получения препарата на основе штамма ВасПцз т 1)цг 1 пд 1 епзз, обладающего противораковой активностью,Известен способ получения препарата на основе штамма Вас 1 Пцз йцгпдепзз.Известный способ включает культивирование штамма, подготовку культуры и разложение молекул дельта-зндотоксина до полипептидов.Недостатком способа является его сложность и трудоемкость, т,к, разложение молекул дельта-эндотоксина осуществляют после удаления спор из споро-дельта-эндотоксиновой смеси,Разложение молекул дел ьта-эндотоксина до полипептидов осуществляют с помощью щелочи, а осаждение - целлюлозно колоночной хроматографией, Это очень сложный и дорогостоящий процесс.(51)5 А 61 К 35/74, С 12 Р 1/04 дельта-зндотоксина до полипептидов, Молекулы дельта-эндотоксина до полипептидов разлагают растворением в щелочи, причем растворение .осуществляют непосредственнов споро-дельта-зндотоксиновой смеси с последующим осаждением полипептидов титрованием концентрированной уксусной кислотой, в качестве растворителя используют едкий натр или едкое кали при соотношении объемов споро-дельта-зндотоксиновой смеси и растворителя соответственно 1;10-1:15, концентрированную уксусную кислоту для осаждения добавляют до достижения рН 4.2 з.п,ф-лы. Известен также способ получения препарата на основе штамма Вас 1 цз йцгпдепзз, обладающего противоопухолевой активностью, наиболее близкий по технической сущности и достигаемому эф фекту, ОИзвестный способ включает культиви-, С) рование штамма ВасП 1 цз йцг 1 пдепзз, под-,ф готовку культуры и разложение молекул д дельта-эндотоксина до полипептидов,Недостатком известного способа является его сложность и длительность, т,к. разложение молекул дельта-эндотоксина осуществляют после удаления спор из спо- (д ро-дельта-эндотоксиновой смеси.Удаление спор осуществляют флотацией. Однако при этом удаляется около 80% спор, а остальные 20 удаляют путем фазового разделения в двухфазной системе "четыреххлористый углеродсернокислый натрий", что требует дополнительных за 1790410трат и также усложняет способ, увеличивает его длительность,Кроме того, разрушение кристаллической структуры дельта-эндотоксина, при котором происходит разложение молекул до полипептидов, что необходимо для использования препарата, осуществляют облучая дельта-эндотоксин ультрафиолетовыми лучами, что требует специального оборудования и удорожает и усложняет способ.Цель изобретения - упрощение способа и повышение его экономичности.Указанная цель достигается тем, что в известном способе получения препарата на основе штамма ВасИцэ Фцгепдепзз, обладающего противоопухолевой активностью, включающем культивирование штамма, подготовку культуры и разложение молекул дельта-эндотоксина до полипептидов, согласно изобретению, культивируют штамм ВасИиэ Йцгпдепэз маг. даИеге, молекулы дельта-эндотоксина до полипептидов разлагают растворением в щелочи, причем это растворение осуществляют непосредственно в споро-дельта-эндотоксиновой смеси, с последующим осаждением полипептидов титрованием концентрированной уксусной кислотой,Целесообразно в качестве растворителя использовать едкий натр или едкое кали при соотношении объемов споро-дельта-эндотоксиновой смеси и растворителя соответственно 1:10 - 1;15,Уксусную кислоту для титрования доба вля ют до достиже н и я р Н 4.Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что культивируют штамм . ВасИцз Эцгпдепзз Чаг, даИеге, молекулы дельта-зндотоксина до полипептидов разлагают растворением в щелочи, причем рас"творение осуществляют непосредственно в споро-дельта-эндотоксиновой смеси с последующим осаждением полипептидов тит рованием концентрированной уксусной кислотой. Способ отличается также тем, что в качестве растворителя используют едкий натр или едкое кали при соотношении обьемов споро-дельта-эндотоксиновой смеси и растворителя соответственно 1:10 - 1:15, а концентрированную уксусную кислоту для осаждения титрованием добавляют до достижения рН 4.Сущность предлагаемого способа наиболее полно раскрыта в примерах его конкретного осуществления,П р и м е р 1. Культивирование ВасИоэ йцгпдепзэ Чаг. дадеге осуществляли на твердой питательной среде в термостате при 28-30"С в течение 10 дней, После чего культуру промыли дистиллированной во 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 дой, затем физиологическим раствором и снова дистиллированной водой. При этом споро-дельта-эндотоксиновая смесь освобождается от растворимых токсинов. В смеси остаются в основном споры и кристаллы дельта-зндотоксина, вегетативные клетки.Для разложения молекул, образующих кристаллы дельта-эндотоксина, до полипептидов, являющихся по сути действующим началом препарата, непосредственно в споро-дельта-эндотоксиновую смесь добавили растворитель - едкий натр, в соотношении объемов 1:10, т,е. на 1 г споро-дельта-эндотоксиновой смеси - 10 мл едкого натра, и выдержали до растворения кристаллов дельта-зндотоксина, постоянно перемешивая, При этом частично растворяется и белок спор, Причем он разлагается также до полипептидов, сходных с полипептидами, на которые разлагаются молекулы дельтаэндотоксина,Осадок, включающий остатки спор и вегетативных клеток, удалили центрифугированием в течение 20 мин, при скорости вращения ротора 5000 об/мин, Возможно удаление осадка и любым другим способом, например фильтрацией. Для повышения чистоты действующего начала (полипептидов) их осадили титрованием концентрированной уксусной кислотой до рН 4.Таким образом препарат, обладающий противоопухолевой активностью, на основе штамма ВасИцэ Йцгепдепзз Чаг, даИеге получен без применения специального оборудования, простым переосаждением дельта-эндотоксина, растворенного щелочью непосредственно в споро-дельта-эндотоксиновой смеси, что значительно ускоряет процесс, делает его более простым и экономичным.П р и м е р 2, Технология аналогична примеру 1, но в качестве растворителя испольэовали едкое кали при соотношении объемов 1:10 т.е, на 1 г споро-дельта-эндотоксинной смеси - 10 мл едкого кали),П р и м е р 3, Технология аналогична примеру 1, но в качестве растворителя брали едкий натр при соотношении объемов 1,15,П р и м е р 4. Технология аналогична примеру 1, но в качестве растворителя использовали едкое кали в количестве 1;15.Противоопухолевую активность препарата на основе штамма Васиз Фигпдепээ Чаг. даеге, полученного предлагаемым способом проверяли на культурах раковых клеток Не а и НеР, Все операции способа для испытания именно на клетках проводили в стерильных условиях,1790410 используя стерильные растворы и вещества,Перед использованием, чтобы нейтрализовать возможное цитотоксическое влияние щелочи на клетки, титровалиодномолярным раствором соляной кислотыдо рН 8. Далее раствор препарата разбавили стерильным буфером следующего соста. ва: 0,8% МдС + 0.02% КС + 0.115%Ма 2 НРОа + 0,02% КН 2 РО 4 + Н 20 - остальное, имеющим рН 7,5 до необходимой концентрации (0,025-0,075 мг/мл). В опытеразбавили до концентрации 0,05 мг/мл, Вэтом же буфере дважды промыли раковыеклетки Не а и НеР, Затем указанные раковыеклетки инкубировали при 28 С с приготовленнымм белково-дельта-эндотоксиновым раствором. Через 1, 5, 10, 15 и 30 мин, а затем через1, 2, 3, 6, 9, 12, 24 и 48 часов раковые клеткиосторожно промывали и тотчас фиксировали,Обработанные клетки исследовали методами световой, электронной сканирующей ипросвечивающей микроскопии,Для световой микроскопии обработанные препаратом раковые клетки промывали4-6 раз фосфатным буфером рН 7,4, фиксировали в фиксаторе Карнуа и окрашиваликристаллическим фиолетовым, Просматривали под световым микроскопом марки Зргавал (ГДР). Хорошо просматривалосьизменение клеток во времени под действием препарата вплоть до их разрушения,При помощи сканирующего микроскопапри увеличении в 5000 раз получены фотографии, показывающие изменение раковыхклеток Не.а во времени под действием препарата, полученного предлагаемым способом непосредственно изспоро-дельта-эндотоксицовой смеси. Ясно видна противораковая активность препарата на основе ВасИ 1 цз Фигп 91 епзз Чаг. цаИеге, полученного более простым способом непосредственно из споро-дельта-эндотоксиновой смеси,Формула изобретения 1. Способ получения противоракового препарата, включающий культивирование штамма . Васиз тЬцг 1 п 91 епз 1 з с последующим разложением дельта-зндотоксинд до полипептидов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и поБелок спор, при добавлении щелочи частично разлагается на полипептиды, сходныес полипептидами молекул дельта-зндотоксина и не снижает противораковой активности5 препарата, что установлено экспериментально,Для контроля раковые клетки культурНе а и НеР обрабатывали по указанной выше технологии, но раствор препарата заме 10 цили раствором щелочи равного объема иконцентрации, Изменений в раковых клетках в указанные выше периоды времени ненаблюдалось,При осуществлении способа получения15 препарата испольэовать едкий натр или едкое кали нецелесообразно в соотношениименьшем чем 1:10, т,к. в этом случае получится перенасыщенный раствор, в которомне все молекулы дельта-эндотоксина могут20 разложиться до полипептидов,Соотношение споро-дельта-эцдотоксиновой смеси и едкого кали или едкого натрабольшее чем 1:15 нецелесообразно, т,к,приведет к непроизводительному расходу25 щелочи. концентрированной уксусной кислоты для титрования,Предлагаемый способ позволяет получить препарат на осцове штамма ВасИизйог 1 п 9 епз 1 з Чаг. 9 дИег 1 е, обладающий про 30 тивоопухолевой активностью, обычным растворецием до полипептидов молекулдельта-эндотоксицд, составляющих его кристаллы, и простым переосаждением действующего цачалд, т,е, полипептидов35 титрованием концецтрированцой уксуснойкислотой, что значительно удешевляет и упрощает способ (за счет сокращения числаопераций, по сравнению с прототипол,уменьшения их сложности и трудоемкости,40 отсутствия специального оборудования),Белок спор, при добавлении щелочи частично разлагается на полипептиды, сходные с полипептидами молекулдельта-эцдотоксица и не сцижает противо 45 раковой активности препарата, что установлено эксп,римецтально. вышения его экоцомичцости, иэ штаммов используют шталм ВдсИ 1 из йцгп 91 епз 1 з Чаг. 9 д Пег 1 е, разложе ие дельта-эндотоксина осуществляют щелочью в споро-дельтаэндотоксицовой смеси, после чего полипептиды осаждают концентрированной уксусной кислотой.1790410 Составитель И.ТарееваТехред М.Моргентал Корректор Н.Ревская Редактор ТИванова Заказ 357 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 2. Способ по п.1, о т л и ч а ю щи й с я тем, что из щелочи используют едкий натр или едкое кали при их соотношении к споро-дельта-эндотоксиновой смеси 10-15;1,З.Способпопп,1 и 2,отличающийся тем,что укаэанную кислоту добавляют до достижения рН 4.