Способ определения фазового состояния биологических объектов при криоконсервации

(51)5 6 01 И 33/48 БРЕТЕНИЕ- У ИСА К АВТОРСКОМ ИДЕТЕ ользование; криобиология. Цель ния - повышение точности способа формативности эа счет регистрации структурных и фазовых переходов ь изобретения: к охлаждаемому биоприкладывают внешние деформирунапряжения и регистрируют скую деформацию биообъекта в проо непрерывного отогрева. По термоеским крИвым определяют турные интервалы существования х фазовых состояний. 2 ил,21) 4903585/22) 21.01,91(56) СгуоЫоо Бюл, М 45проблем криобиолУССРцкий В.Ю,Васил ии и криоский и ду, 1972, ч.д, р. 429 -ОПРЕДЕЛЕНИЯ ф БИОЛОГИЧЕСКИХ ОКОНСЕРВАЦИИ ВОГО БЬЕК 54) СПОСО СОСТОЯНИ ТОВ ПРИ КР Изобретение относится к криобиологии и может найти применение при исследовании процессов, происходящих в охлаждаемых биологических объектах.Известен способ определения фазового состояния биообъектов методом парамагнитного резонанса.Недостатки способа - невозможность исследования тканей и низкая информативность способа,Наиболее близким к заявляемому является способ определения фазового состояния воды в биообъектах с помощью световой микроскопии, основанный на изменении оптической плотности жидкой фазы при ее кристаллизации или изменении вращения плоскости поляризации света.Недостатками способа являются низкие точность и информативность способа,Эти недостатки обусловлены следуюопределение фазовых состояний, соответствующих определенным температчрам и временным интервалам,В случае исследования тканей готовятсяих ультратонкие среды, при этом кинетикакристаллизации воды в таких срезах можетсущественно отличаться от кинетики кристаллизации в объемных образцах как за Осчет поверхностных эффектов, так за счет,ъ фвоздействия на жидкие фракции фиксирую- С)щих и красящих препаратов. Кроме этого,происходит маскировка процессов внутри-эклеточной кристаллизации внеклеточнымльдом. Все это снижает точность получаемой информации,Способ не позволяет осуществлять непрерывную регистрацию фазового состояния биообъекта в процессе их охлаждения инагрева, что делает способ малоинформативным,Цель изобретения - повышение точности и информативности способа за счет регистрации кинетики структурных и фазовыхпереходов. Образцы перед исследованием обрабатывают фиксирующими и красящими растворами, которые вносят погрешности в ОСУДАРСТВЕ ННОЕ ПАТЕ Н ТНОЕЕДОМСТВО СССРОСПАТЕНТ СССР) 57) Исп изобрете и его ин кинетики Сущност обьекту ющие пластиче цессе ег пластич темпера различны 1780001 А 110 20 1 остэвленная цель достигается тем, что : способе определения фазового состояния. логи;осих объектов при криоконсерви:; к, включающем охлаждение образцаоследу ощую регистрацию его физических. э ктеристик, к охлажденному образцу и ри,лыоэют внешние деформирующие напрялия, затем проводят отогрев образца, при м в процессе непрерывного отогрева ре;. стоиоуют его термоплэстическую дефор) )Способ поясняется следующим примеОбразцц тканей головного мозга, сердца, печени, почек, желудка, поперечно-полосатои мышцы крысы и эритромассы человека, инкубированной с 30%-ным водз ным раствором глицерина, объемом 0,5 см помещали в устройство для излучения упруго-пластических свойств замороженных растворов и биообьектов и охлаждали со скоростью 4 град/мин до -170 С с последуощей стабилизацией температуры в течение 10 мин, Затем к исследуемым образцам тканей прикладывали деформирующие напрпкенлп о-.= 400 г/мм, а к образцам из2эритромэссы 200 г/мм, Величина деформирующих напряжений выбиралась такой, чтобы с одной стороны, не вызывать пластическо,; деформации образца при конечной темпера гуре охлаждения, а с другой - обеспсчиэть оптимальную разность в скорости пласт; ческога течения образца при происходящих в нем фазовых переходах, После приложения деформирующих напряжений осу ествляпи отогрев исследуемых образ;и со скоростью 1 град/мин с одновременсй регистрацией термопластической;:ивой в координатах е =г (Т) при о= ; спет, где г - пластическая деформация образца, г - прикладываемое деформирующе напряжение,Термоплэстические кривые были пол: ены для всех вышеуказанных образцов, ,"ивич, - :ый вид таких кривьх для клеточных суспензий показан на примере эритромэссы (фиг.1, кривая 1), для тканей на примере по геречно-полосатой мы ш ць (фиг,1, кривая 1). Представленные кривые имеют ярко выакенный многостадийный характер, пои- :м каждая из стадий соответствуст спредепенному фэзовому состоянию блообъекта, Зто связано с тем, что упруго-пла,:тические характеристики отдельных фракций образца при их переходе от жидкои к кристаллическому иги застекловэнному состояниям изменяется на несколько по; ядксв по абсолютной величине, Соответственно изменяется сопротивление ткани 25 30 35 40 45 50 55 внсшним напряжением, а значит и ее гуммарная пластическая деформация к,1 ь происходя щая под действием этих напряжений за определенньй промежуток времени Л 1, В свою очередь изменения величины Ж ь сопровождающие фазовые переходы в исследуемых образцах, приводят к характерным перегибам на термопла. стических кругах, что крайне упрощает процедуру определения температурных интервалов существования определенных фазовых состояний биообъектов,Согласно полученным кривым (фиг.2) в интервале температур -180-150 С образ цы тканей находятся в эакристаллизованном состоянии с высокостабильной структурой, Диффузионные и рекристаллизационные процессы в этом интервале температур в них подавлены, в результате чего скорость нарастания пластической деформации с повышением температуры здесь практически равна нулю, Выше температуры -150 С в замороженных тканях начинаются рекристаллизационные процессы, которые протекают вплоть до температур -8 ООС. На графике (фиг,1, фиг.2) эта стадия характеризуются нарастанием деформации яс повышением температур. Скорость деформации здесь пропорциональна интенсивности протекания рекристаллизационных процессов. После завершения рекристаллизации структура образца вновь стабилизируется, что отражается нэ термопластических кривых уменьшением скорости пластической деформации, Таким образом, область протекания рекристаллизационных процессов выделена на термопластической кривой специфическим перегибом и хорошо определяется экспериментально. При дальнейшем повышении температуры начинаются процессы расстеклования биополимерных комплексов и плавления образовавшихся в образцах кристаллов льда, которые сопровождаются резким увеличением пластичности образцов. Температура начала этих процессов Тпл. для разных тканей может сильно отличаться, что следует из фиг,2. Так для тканей головного мозга (кривая 1) Тпп = 77 С, Для ткани почки крысы (кривая 2) Тпп, = -б 1 С, ткани сердца крысы и (кривая 3) Т.пп, =-44,5 С, ткани по- перечно-полосатой мышцы крысы (кривая 4) Тпп. =-43 С, ткани желудка крысы (кривая 5) ,пп, =-38 С.Таким образом способ позволяет не только определять температурные интервалы происходящих в образце структурных и фазовых переходов, но и проследить их кинетику Измеряемые пластические характеристики.1780001 д, ль,са оо котооые при переходе от одного фаэовогс состояния к другому изменяются по величине на несколько порядков, однозначно отображают происходящие в образце фаэовые и структурные превращения. 5Формула изобретенияСпособ определения фазового состояния биологических объектов при криоконсервации, включающий охлаждение образца и последующую регистрацию его 10 физических характеристик, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что, с целью повышения точности способа и его информативности за счет ре. гистрации кинетики структурных и фазовых переходов, к охлажденному образцу прикладывают внешние деформирующие напряжения, затем проводят отогрев образца, при этом в процессе непрерывного отогрева регистрируют его термопластическую деформацию.,Кулаков Тираж ПодписноеГосударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ 113035, Москва, Ж, Раушская, наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина,каз 44 ВНИ оставител ехред М.М