Способ определения морозостойкости растительных образцов

(В 9) (11) 51)5 А 0167/00, А 01 ГОСУДАРСТВЕННЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР МИТЕТОТКРЫТИЯМ ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН АВТОРСКО ВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) СПОСОБ ОПСТОЙКОСТИ РАСТ ударственн .Холостова универ- В.В,Фиетельство С Н 1/04, 1973 РЕДЕЛЕНИЯ ИТЕЛЬНЫХ МОРОЗ РАЗЦО о об ож Изобретение относится к физиологиирастений и микроорганизмов, имеет отношение к консервированию жизнеспособныхклеток и тканей, может быть использованов технической микробиологии, сельском хозяйстве и селекции как метод лабораторного диагностирования морозоустойчивостиобразцов.Известны способы установления морозостойкости растительных образцов по состоянию воды и способности клеток кплазмолизу,Известен способ определения морозостойкости растительных образцов с пом щью метода ЯМР-спиновое эхо.Недостатком известного способа является невозможность установления месталокализации льда в клетке, а также необходимость достижения температур, прикоторых замерзает вода гидратной оболочки,Цель изобретения - упрощение спос аи расширение его функциональных возмн остей,(57) Использование: техническая микробиология, физиология растений и микроорганизмов. Сущность изобретения, производят измерение температурной зависимости отношения времен релаксации Т 1 и Т 2 протонов воды в области кристаллизации свободной воды и по форме кривой судят о внутриклеточной или внеклеточной кристаллизации воды, считая морозостойкими образцы, в которых кристаллизация воды происходит внутриклеточно, 1 ил 2 табл,Поставленная цель достигается измерением температурных зависимостей (ТЗ) отношения времен спин-решеточной (Т 1) и спин-спиновой (Т 2) релаксации протонов воды в температурном интервале замерзания свободной воды и по форме кривой судят о месте локализации льда,На чертеже показан график, отражающий внеклеточную и внутриклеточную кристаллизацию воды.В жидкостях отношение Т 1/Т 2=1, а в твердых телах Т 1Т 2. Для биологических объектов из-за энизотропии оно всегда выше единицы. Исследование динамики Тз отношения в области кристаллизации свободной воды может дать информацию о месте локализации льда, В клетках, содержащих высокое количество прочносвязанной воды, отношение Т 1/Т 2 после достижения максимума не снижается; в клетках, содержащих высокое количество свободной воды, отношение снижается, Данное обстоятельство объясняется тем, что при образовании центров кристаллизап А - и А 40 45 50 55 ции воды вне клетки (в оболочке, в межклетниках, во внеклеточной среде) внутриклеточная вода начинает диффундировать по направлению к месту локализации льда (явление осмоса), снижая тем самым отношение Т 1/Т 2. Таким образом, кривая 2 на чертеже отражает внутриклеточную кристаллизацию воды, а кривая 1 - внеклеточную,П р и м е р 1. Суспензию СЫогеа чцдагз центрифугируют в течение 20 мин при 3000 д и получают биомассу исходной влажности 80;. Биомассу герметизируют в стеклянные ампулы с малым свободным объемом; длина рабочей части 40 мм, внутренний диаметр 8 мм, максимальный объем 2 см . Ампулу помещают в катушку датчика релаксометра, находящейся в поле постоянного магнита напряженностью 4,9 кЭ. Измерения спада амплитуды спинового эха от протонов воды проводят на установке спинового эха ЯМР, применяемой для импульсных спектрометров типа ЯМР. Для Т 1 используют программу подачи импульсов 90 - 180 - 90; для Т 2 - 90 - 180; продвижение строб-импульса автоматическое. Поскольку спад амплитуды эха от протонов воды строго экспоненциален, вычисляют единственное время релаксации длин Т и Тг по формуле где х, г 2 - интервалы между импульсами; А, А - амплитуды, соответствующие временным интервалам, Значения амплитуд брались в момент времени 2 т при подаче импульса в момент времени сТермостатирование образцов осущест.вляли по методике Попла. Градиент температуры внутри образца не превышал 1 С, точность поддерживаемой температуры +1 С, образец выдерживался при данной температуре 15 мин, Спад амплитуды спинового эха для Т 1 и Тг составлял 3-5. В каждом температурном режиме снимали 4-5 экспонент сигнала спин-эха. Отклонения от среднего значения для времен релаксации не превышали 8-10(табл. 1).Времена релаксации и отношение Т 1/Т 2 для хлореллы (влажность 80 ф ) при температурах от 20 до -20 С представлены в табл, 1.На чертеже (кривая 1) и в табл. 1 представлены результаты Тз отношения Т 1/Т 2 5 10 15 20 25 30 35 для микроводоросли Сапогеа чцдагз, которые указывают на внеклеточную локализацию льда при замораживании. Данные работы по электронной микроскопии СЫ.чцдагз после температурного воздействия (при -1,5 и -5 С) подтверждают сделанный вывод. После воздействия указанными температурами в клетках хлореллы наблюдается плазмолиз и деформация клеточной стенки (оболочки).Однако установленный механизм образования льда в оболочке позволяет при правильно подобранном режиме замораживания получать жизнеспособные клетки.П р и м е р 2, Суспензию водородоокисляющей бактерии Асадепез ецюорйа гцентрифугируют при 5500 д 15 мин и получают биомассу влажностью 75 , Все дальнейшие операции проводят по разработанной схеме (опыт 1), На чертеже (кривая 2) и в табл. 2 приведены экспериментальные данные для Асадепез ецсгорЬа г, которые показывают, что вода замерзает сразуже внутриклеточно; сделанный вывод подтверждают результаты электронной микроскопии,Времена релаксации и отношение Т 1/Т 2 для бактерии (влажность 75) при температурах от 20 до -20 С представлены в табл, 2.Содержание в клетках бактерий прочносвязанной воды позволяет применять более жесткие режимы сушки и замораживания.Предлагаемый способ позволяет устанавливать вне- и внутриклеточную кристаллизацию льда в мелких клетках (бактерии, микроводоросли и др,). Формула изобретения Способ определения морозостойкости растительных образцов путем анализа состояния воды в клетках методом ЯМР-спиновое эхо, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и расширения функциональных возможностей метода, методом ЯМР-спиновое эхо измеряют температурную зависимость отношения времен релаксации Т 1 и Т протонов воды в области кристаллизации свободной воды и по форме кривой судят о внутриклеточной или внеклеточной кристаллизации воды, считая морозостойкими образцы в которых кристаллизация воды происходит внутри- клеточно,1738150 Ттl СоставительРедактор Н. Тупица Техред М.Моргентал Коррект ундр оизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина аз 194 Ъ ТиражВНИИПИ Государственного комитета и113035, Москва, ЖПодписноезобретениям и открытиям при ГКНТ ССРаушская наб., 4/5