Способ определения холинсодержащих фосфолипидов в биологическом материале

(51 РЕТЕ тви- още,А.Н. Бах аццез без Раув НИЯ ХОЛИНСО ПИДОВ В БИОЛО тся к медицине и для количественсодержащих фосском материале. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗО АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛДЕРЖАЩИХ ФОСФОЛИГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ(57) Изобретение относиможет быть использованоного определения холинфолипидов в биологиче Изобретение относится к практическойбиохимии и может быть использовано в клинической медицине, в микробиологической, пищевой и парфюмернойпромышленности, в фармакологии и в животноводстве, в области биотехнологии и вдругих областях.Цель изобретения - увеличение чувствительности и селективности, а также упрощение способа,Способ поясняется чертежом, где представлены калибровочные кривые для холинсодержащих фосфолипидов (ФХ, лизоФХ, СМ),Способ осуществляется следующим образом,Для определения используют холинсодержащие фосфолипиды (фосфатидилхолин,лизо-фосфатидилхолин или сфингомиелин),растворенные в хлороформ-метальной смесиили в этаноле, К пробам добавляют 3 мл хлороформа и краситель катион-анионнойформы триарилметанового ряда (например,Цельтельнниеспецщихкрасиныешенорганв 30веннопрефосфдержв 7,5 изобретения - повышение чувс ости и селективности, а также упр способа. Способ основан на ифическом связывании холинсодержафосфолипидов с триарилметановыми телями, содержащими анион-катеонгруппировки, с образованием окраных комплексов, растворимых в ической фазе. Изобретение позволяет - 100 раэ быстрее проводить количестй анализ фосфолипидов, позволяет делять количество холинсодержащих олипидов в присутствии холиннесоащих фосфолипидов. Способ обладает раз большей чувствительностью; 1 ил,кислотныи синии 9, кислотныи синии 7, кислотный синий 1, кислотный фиолетовый 17 и т,д,), Краситель может быть добавлен в виде водного раствора, а также растворенным в смесях вода - глицерин (в различных соотношениях), глицерин - метанол (в различных соотношениях, но не более 80 О/ метанола), вода - ацетон (в различных соотношениях, но не более 20 О ацетона), а также в виде сухого вещества, Количество холинсодержащих фосфолипидов прямо- пропорционально интенсивности окраски хлороформенной фазы. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны, соответствующей максимуму поглощения для используемого красителя. Прямая пропорциональность наблюдается в интервале 5 - 80 мкг холинсодержащих фосфолипидов; т.е, от 0 до 2,5 ед, (А) (см. чертеж калибровочные кривые для ФХ. лизо-ФХ, СМ) для различных катион-анионных триарилметановых красителей, 1691744В случае небольшой мутности образцов, которая, как правило, не мешает определению, можно к окрашенному хлороформенному экстракту перед измерением добавить порошок - безводного сульфата натрия (около 100 мг/образец), который быстро убирает остаточную мутность и не мешает определению. Другим способом устранения слабой мутности образцов является предварительное кратковременное, низкоскоростное центрифугирование (1 - 2 мин при 2 - 2,5 тыс.об.) образцов для расслоения хлороформенной и водной фаз, Образовавшаяся окраска стабильна длительное время (несколько месяцев), если только не происходит химическая или ферментативная деградация фосфолипидов и испарение хлороформа. Стабильность приготовленных растворов красителей составляет более 1 г,Время определения одного образца около 5 мин, для 10 образцов около 10 мин, Коэффициент вариации для 10 одинаковых образцов 3,280, В предлагаемом способе обеспецивается как минимум в 7,5 раза большая чувствительность количественных определений холинсодерджащих фосфолипидов, цем в известном способе (метод Беттчера) при сохранении абсолютной селективности (нулевое окрашивание) для холиннесодержащих фосфолипидов и в 9 раз быстрее, чем в известном способе (45 мин - известный и 5 мин - предлас аемый способ).П р и м е р 1, Краситель - кислотный синий 9, Эриоглауцин, Асс Вое 9, Ег 9 аоспе, АрИоакчгпе Р,ОС .42090, АЫгсЬ, ОБА), К аликвотам, содержащим 5 - 80 мкг холинсодержащих фосфолипидов - фосфатидилхолин (ФХ), лизо-фосфатидилхолин (лиэо-ФХ) или сфингомиелин (СМ) в 2 - 3 повторах для статистицеской обработки результатов, в небольшом объеме хлороформа или спирта (до 100 мкл) добавляют по 3 мл хлороформа и смесь тщательно перемешивают (растворение фосфолипидов), К пробам добавляют по 1 мл водного раствора анион-катионного триарилметанового красителя - кислотный синий 9, (3,0 мг в 1 мл воды). Смесь интенсивно встряхивают для полного перемешивания фаз. Далее образцы оставляют стоять прикомнатной температуре для постепенного расслоения фаэ (3 - 5 мин) и затем, удалив верхнюю фазу на водоструйном насосе Пастеровской пипеткой или отобрав нижнюю фазу шприцем, измеряют оптицескую плотность (А) на спектрофотометре образовавшейся окраски хлороформной фазы при 625 нм, т,е. при длине волны, соответствующей максимуму поглощения для данного триврилметаново 5 10 20 го красителя, Измерения проводят в обычной четырехмиллиметровой кювете с длиной оптического пути 1 см против контроля со всеми добавками, кроме фосфолипида, Полученные калибровочные кривые представлены на чертеже, Интенсивность окраски комплекса фосфолипид-краситель прямо пропорциональна количеству добавленного фосфолипида (ФХ, лизо-ФХ, СМ) в интервале 0 - 2,5 ед. (А), Следует также отметить высокие величины контролей (около 0,7 - 1,0 ед.А) при сохранении линейной зависимости (А) от количества измеряемых фосфолипидов. Высокие величины контролей могут быть существенно снижены промывкой образцов (1 - 2 раза) 2 мл воды до величин О,05 - 0,1 ед. (А), при этом чувствительность способа не меняется и соответствует тем калибровочным кривым, которые представлены на чертеже,П р и м е р 2, Краситель - кислотныйсиний 7, Альфазурин А, Патентованный синий А, (АсЫ Вое 7, Арйагчгпе А, Ра 1 еп ВЬе25 А, С42080, АЫгсЬ, ОБА)Предварительно готовят водный раствор красителя из расчета 3,0 мг на 1 мл.Способ осуществляют как указано в примере 1, Интенсивность образовавшейся ок 30 раски измеряют при 637 нм. Полученныекалибровочные кривые аналогичны кривым,представленным на чертеже. Используемыйкраситель - , кислотный синий 7 являетсяанион-катионной формой триарилметано 35 вых красителей,П р и м е р 3. Краситель - кислотный синий1, Патентованный синий ВФ (АсО Вце 1.Райеп 1 Вое ЧР, С, , 42045, АЫгсЬ, ОБА),Предварительно готовят водный рас 40 тоор данного красителя иэ расчета 3,0 мг на1 мл.Способ осуществляют аналогично примеру 1,Интенсивность образовавшейся окра 45 ски измеряют при 630 нм. Полученные калибровочные кривые аналогичны кривым, представленным на чертеже, Используемый краситель является катион-анионной формой триарилметановых красителей,50П р и м е р 4. Краситель - кислотныйфиолетовый 17 (АсЫ Чоес 17, С,.42650, Ас 3 гсЬ ОБА)Предварительно готовят водный раствор красителя иэ расчета 3,0 мг на 1 мл.Способ осуществляют аналогично примеру 1, Интенсивность образовавшейся окраски измеряют при 545 нм. Полученные калибровочные кривые аналогичны кривым, представленным на чертеже.5 10 15 20 25 30 35 40 45 Используемый краситель - кислотный фиолетовый 17 является анион-катионной формой триарилметановых красителей,П р и м е р 5, Краситель в аиде сухого порошка,К пробам. содержащим фосфолипиды, и к контрольным пробам(см.пример 1) добавляют на кончике шпателя по 0,5 мг красителя Кислотного синего 1 и оставляют стоять на 15 - 20 мин. При этом развивается окраска, пропорциональная количеству добавленных фосфолипидов, содержащих холин. Способ особенно удобен для определения количества холинсодержащих фосфолипидов в пятнах после тонкослойной хроматографии. Интенсивность окраски измеряют при 630 нм,П р и м е р 6. Определение холинсодержащих фосфолипидов в присутствии холиннесодержащих.К опытным и к контрольным образцам, полученным, как указано в примере 1, добавляют по 200 мкг кардиолипина или фосфатидилглицерина, или фосфатидилсерина, или фосфатидной кислоты, или фосфатидилэтаноламина. Все дальнейшие процедуры проводят аналогично примеру 1, добавляя по 1 мл одного иэ перечисленных выше красителей. Полученные калибровочные кривые полностью совпадают с калибровочными кривыми, полученными в отсутствие холиннесодержащих фосфолипидов, Таким образом, предлагаемый способ позволяет избирательно (селективно) определять количество холинсодержащих фосфолипидов в присутствии холиннесодержащих.Общим свойством всех испытанных красителей (см, примеры 1 - 4) является наличие анион-катион ных группировок, расположенных на триарилметановой структуре исследованных красителей, что является определяющим при образовании комплекса красителей триарилметанового ряда с различными холинсодержащими фосфолипидами только при наличии анионкатионных группировок. Вместе с тем катионные формы триарилметановых красителей - Виктория голубой Р и Виктория голубой В не способны образовывать окрашенные комплексы с холинсодержащими фосфолипидами в органической фазе,Использование предлагаемого способа обеспечивает по сравнению с известными способами следующие преимущества: чувствительность предлагаемого способа в 7,5 раза выше, чем у известного способа; время, необходимое для проведения одного определения около 5 мин, (у известного способа более 45 мин, т,е. в 9 раз быстрее); по сравнению с известным способами (за базовый принят способ Васьковского) предлагаемый способ позволяет ускорить определение в 35 - 40 раз, а учитывая необходимость количественного выделения фосфолипидов перед определением по способу Васьковского и отсутствие такой необходимости для предлагаемого способа выигрыш во времени составляет как минимум в 100 раз; чувствительность предлагаемого метода более, чем в 5 раэ выше, чем в методе Васьковского; предлагаемый способ позволяет избирательно (селективно) определять количество холин- содержащих фосфолипидов в присутствии холин несодержащих,Формула изобретения Способ определения холинсодержащих фосфолипидов в биологическом материале путем экстракции органическим растворителем, контактирования экстракта с реагентом с последующим спектрофотометрическим измерением содержания полученного продукта, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью увеличения чувствительности и селе ктивности, а также упрощения способа, контактирование проводят встряхиванием в бифазной системе органический растворитель: водная среда, а в качестве реагента используют краситель триарилметанового ряда, содержащий анионные и катионные группы.1691744 2,80 УО 100 (нкг фос 0 20 30 50 Составитель А.АгуреевТехред М.Моргентал едактор Н,федоро орректор И.Муска Заказ 3924 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 10 Рою 3,0 лизо-ФХси Предлагаеный слосоо