Способ определения желчных кислот в биологической жидкости

(55 б 01 М ЗЗ/50 ПИСАНИ ЗОБ ЕТЕН г1. 2 ерситет нко и 3, с. 176 - 1 ЛЧНЫХ Д КОСТИ химии и деления дкостях. ности и включаЦельние желчтериалаэтанола сляет сохшить прпробах,ГОСУДАР СТВ Е ННЫ Й КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛ ЬСТ 8 У(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖЕ КИСЛОТ В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИ (57) Изобретение относится к био может быть использовано для опре желчных кислот в биологических жи Цель изобретения - повышение точ чувствительности способа. Способ Изобретение относится к биохимии и применимо для изучения обмена желчных кислот в организме животных и при физиологических исследованиях функционального состояния гепатобилиарной системы, а также может быть использовано в медицине для диагностики и контроля за ходом лечения при заболеваниях печени,Цель изобретения - повышение точности и чувствительности способа. достигается тем, что экстрагироваых кислот иэ биологического мапроводят при (-10-0 С) смесью ацетоном (1:3). Последнее позвоанять тауроконьюгаты и уменьимеси липидного характера в Хроматографическое разделение своодных и коньюгированных желчных кислот роводят в системе, включающей амиловый ет экстрагирование желчных кислот иэ биологического материала при пониженных температурах и смесью этанола с ацетоном (1:3), хроматографическое разделение в гомогенной общей системе растворителя для свободных и коньюгированных желчных кислот, состоящей иэ амилового эфира уксусной кислоты, толуола, бутанола и воды (3:1:1:3:1), Количественная денситометрическая оценка содержания желчных кислот осуществляется после окрашивания хроматограмм комплексным красителем, включающим 15 мл ледяной уксусной кислоты, 1 г фосфорномолибденовой кислоты, 1 мл концентрированной серной кислоты и 5 мл 50;ь-ного водного раствора трихлоруксусной кислоты. 3 табл. эфир уксусной кислоты, толуол, бутанол, уксусную кислоту и воду в соотношении (3:1:1:3:1), которая позволяет одновременно разделить свободные и коньюгированные желчные кислоты при одномерной хроматографии на стандартных пластинах "ЯМоГ. Это сокращает время хроматографического анализа и уменьшает расход материалов и реактивов. Количественную оценку содержания каждой желчной кислоты проводят после опрыскивания хроматограмм 5-ным раствором фосфорномолибденовой кислоты в смеси, включающей ледяную уксусную кислоту, концентрированную серную кислоту и 50- ный раствор трихлоруксусной кислоты при соотношении 15;1:5. Это йоэволяет проявлять при 60-70 С без изменения фона. Чувствительность метода 0,25-0,35 мкг для каждой свободной или конфьюгированной желчной кислоты, что более чем в два разапревышает чувствительность способа прототипа,Способ осуществляется следующим образом.0,1 мл желчи или 0,2 мл цельной крови человека или животного вносят в стеклянную центрифужную пробирку, в которую предварительно налито соответственно 1,9 или 1,8 мл охлажденной экстрагирующей смеси этанола с ацетоном (1:3), Дуоденальное содержимое сперва необходимо гомогенно диспергировать в дистиллированной воде (разведение в 2 раза), а затем 0,5 мл взвеси внести в пробирку, где ранее налито 4,5 мл указанной смеси органических растворителей, После тщательного перемешивания стеклянной палочкой содержимого пробирки ставят в морозильное отделение холодильника на 25 - 30 мин. Затем пробы центрифугируют 10 - 12 мин при 3000 - 4000 об/мин,сливают экстракт в конусовидные стеклянные пробирки и упаривают при 37-40 С под вытяжным шкафом до сухого остатка (процесс можно ускорить с помощью вакуум-шкафа), Сухой остаток растворяют в смеси этанола с водой (6:4) в зависимости от исследуемого биологического материала в 10 - 20 мкл при анализе крови или 50-100 мкл при исследовании желчи.Исследуемые вытяжки по 5 или 10 мкл наносят на предварительно промытые и размеченные хроматографические листы. Хроматографическое разделение свободных и конЪюгированных желчных кислот осуществляется в системе амиловый эфир уксусной кислоты,толуол, бутанол,уксусная кислота и вода (в соотношении 3:1:1:3:1) в стеклянных прямоугольных камерах. Одномерная хроматография позволяет на хроматографической пластине 15 х 15 см провести 8-9 анализов.Для количественного определения содержания отдельных желчных кислот с помощью денситометра в отраженном свете ( Л - 620 нм) - пятикратное опрыскивание хроматограмм из мелкодисперсного стеклянного пульверизатора следующим красителем: 15 мл ледяной уксусной кислоты, 1 г фосфорномолибденовой кислоты, 1 мл серной кислоты и 5 мл 50-ного раствора трихлоруксусной кислоты, Хроматограммы проявляли при 60-70 С в течение 5 мин,В табл. 1 представлены данные о содержании желчных кислот в желчи и крови человека, полученные при определении способом Громашевской и др, и предлагаемым способом. Иэ этих данных видно, что при определении содержания желчных кислот в желчи методом Громашевской и др,5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 количество тауроконЪюгатов уменьшено на 23,6%, но в сумме возросло на 26,7;(, содержание свободных желчных кислот.Для сравнения чувствительности и точности способа со способом-прототипом представлена табл, 2 о зависимости между количеством нанесенной на хроматограмму желчной кислоты и цифровыми показателями с интегратора денситометра ОР(Шимадзу, Япония), в которых одновременно учтена интенсивность поглощения света (Л) окрашенным пятном, величина его площади и вычтено поглощение исходного фона на равной площади пятна, Данные приведены на примере холевой кислоты.Результаты исследований по влиянию температурных режимов на экстракцию желчных кислот приведены в табл, 3,Приведенные в табл. 3 данные, в частности по суммарному содержанию желчных кислот, показывают, что предложенная смесь органических растворителей при 10- 20-кратном разведении исследуемой желчи практически одинаково экстрагирует желчные кислоты во всех исследуемых температурных режимах и обладает высокой депротеинизирующей способностью. Вместе с тем при экстракции в условиях физиологического и комнатного температурных режимов в экстракте желчных кислот присутствовала в значительных количествах примесь органического компонента (скорее всего липидного характера), которая на тон/кослойных хроматограммах затрудняла прямое определение содержания гликохолевой кислоты и необходимо было прибегать к косвенным расчетам для этой кислоты. Экстрагирование охлажденной смесью органических растворителей в условиях нижнего отделения холодильника вело к снижению содержания примеси до уровня, который позволил прямо определять концентрацию гликохолевой кислоты, а при экстракции в условиях низкотемпературного морозильного отделения холодильника эта примесь практически не попадала в экстракт желчных кислот, Последние условия экстракции желчных кислот (-10 - 0 С) определены как оптимальные и легковоспроизводимые в любой лаборатории,Предлагаемый способ позволяет в сравнении с прототипом повысить более чем в два раза чувствительность (обнаруживает 0,25 - 0,35 мкг желчной кислоты на хроматограмме, в то время как в прототипе около 1 мкг исследуемых кислот); высокая чувствительность способа позволяет применить его в микроисследованиях. при этом не требуется внутривенный отбор крови, так как для624322 анализа необходимо не более 0,2 мл цельной крови, которую можно взять из пальца. смесью этанола с ацетоном при их объемном соотношении 1,3 при температуре -10 - 0 С, концентрирование осуществляют при 37-40 С, п ри хроматографическом разделе нии в качестве растворителя используют систему, содержащую амиловый эфир уксусной кислоты, толуол, бутанол, уксусную кислоту и воду при их соотношении (3:1:1:3:1), а окрашивание хроматограмм 10 проводят 5;-ным раствором фосфорномолибденовой кислоты в смеси ледяной уксусной, концентрированной серной и 50 ь-ной трихлоруксусной кислот, взятых в соотношении 15:1:5 (по объему),ТаблицаФормула изобретения Способ определения желчных кислот в биологической жидкости путем экстрагирования их иэ исследуемого материала, концентрирования и хроматографического разделения экстракта на силикагеле, окрашивания хроматограмм раствором фосфорномолибденовой кислоты с последующей денситометрией, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности и чувствительности способа, экстракцию проводят Гликохолевая кислота Таурохенодезоксихолевая + тауродезоксихолевая кислотыХенодезоксихолевая + дезоксихолеваякислоты Таурохолевая кислота Способ ол реда.ленив желчных кислот г/л А, Печеночная желчь 2,796 О,3 2.964 О,4 0,8670,090,5260,04 1,5950,11,2580,09 1,23 О,2 1,456О.1,372 О.5 1,82 0,09 3,875О,83,937 О,2 Прототип МНе обнаруживается 0,278 0,04 0.223 0.009 0,669 0,08 0,498 0.05 1,093 0,03 Предле- М гвемыЯ +В способ Не обнаружвг 8, ельная к вь, г/л М 0,0028 0.0022 0 0067 0,0050 0.0109 Таблица 2 П ототип П е агаемый способ Показатели с интегратора денситомет а пКол - во холевой кисло П+В П+В ты,мкг 20 15 10 5 2,5 1 0,9 0.8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 54657 41312 24480 11014 5263 1875 1824 1793 1761 1726 1671 1592 1546 1487 1473 3869 2741 1516 647 314 122 115 108 109 93 96 87 84 78 72 20 15 10 5 2,5 1 0,9 0,8 0.7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 47390 39685 26890 12470 4968 1736 1578 1381 1232 1028 848 698 539 376 318 2472 1925 1411 1109 278 93 87 81 67 54 48 41 32 29 271624322Твбвицв 3Составитель А, Агуреев Редактор О. Спесивых Техред М.Моргентал Корректор И, Эрдейи Заказ 184 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101