Способ хранения незрелых эмбрионов пшеницы

вании, при этом семена пшеницы через 16-20 сутки после самоопыления помещают в 0,3-0,75 .-ный раствор диметилсульфоксида (ДМСО) на 20-24 ч, после чего осуществляют дегидратацию в вакуумном эксикаторе с СаС 1 при температуре (+2)-(+4) С, При уменьшении влажности незрелых семян до 20-25 их криоконсервируют путем помещения в пары жидкого азота, после чего погружают в жидкий азот. Отогрев проводят на водяной бане при +40 С. Жизнеспособность эмбрионов определяют после отделения незрелых эмбрионов от семян 15 и их культивирования на среде Гамборга, В.Выбор температурных параметров для дегидратации в интервале (+2) (+4) С обусловлен тем, что именно в этих пределах температур происходит пр едотвращение функциональных повреждений тканей незрелых эмбрионов при дегидратации.Дегидратация незрелых эмбрионов 25опри +105 С резко снижает жизнеспособ - ность незрелых эмбрионов пшеницы вследствие повреждений, возникающих в результате нарушения ростовых процессов, обусловленных патологически ми изменениями межклеточных взаимодействий и нарушением механизмов проницаемости мембранных структур клетки.Снижение жизнеспособности незрелых семян при дегидратации при температу-,о 35 рах ниже 0 С свдетельствует о том, что часть слабосвязанной с макромолекулами воды, находящейся в эмбрионе, замерзает и образует кристаллы льда, которые повреждают клеточные мембраны.40 При размораживании этот лед может ре - кристаллизоваться и вызвать еще большие поврежпения клеток, Обезвоживание незрелых семян пшеницы до 20-25 ,-ной влажности обусловлено тем, что при более низких или более высоких уровнях содержания воды происходит повреждение жизненно важных процессов,определяющих жизнеспособность эмбрионов после криоконсервации в условиях жидкого азота.Проведение двухэтапной криоконсервации обеспечивает полную сохранность жизнеспособности эмбрионов. В случае проведения прямого погружения незре 55 лых семян в жицкий азот происходит повреждение эмбрионов. Это связано с тем, что часть воды, составляющая подвижный компартмент слабосвязан-ной воды, может локально кристаллизоваться и повреждать внутреннюю ор-. ганизацию клетки.В результате проведенных исследований установлено, что для сохранения жизнеспособности эмбрионов пшеницы важными являются следующие условия подготовки незрелых. эмбрионов пшеницы к хранению: осуществление обработки на 16-. 20 сутки после самоопыления; оптимальной является концентрация криопротгктора в пределах от 0,3 до 0,75 ; время инкубации незрелых зародышей в растворе криопротектора составляет 20 - 24 ч.П р и м е р 1. Проводят исследование опытных образцов семян пшеницы Харьковская 11. Растения выращивают в полевых условиях. Через 14,16,18, 20,22 суток после самоопыления незрелые семена. помещают в 0,1; 0,3;0,5; 0,75; 1,0 -ный раствор ДМСО на 22 ч. После этого семена дегидратируют при температуре +4 С в вакуумном эксикаторе на СаС 1. При достижении влажности 20 семена замораживают путем помещения в пары жидкого азота, а затем непосредственно помещают в жидкий азот. Отогрев проводят при температуре +40 С на водяной ба-. не. Жизнеспособность отделенных от незрелых семян эмбрионов определяют путем подсчета количества каллусов на среде Гамборга В через 7 дней рекультивирования .Результаты исследований жизнеспособности незрелых эмбрионов пшеницы сорта Харьковская 11 при инкубации в растворах ДМСО представлены в табл. 1.П р и м е р 2. Растения пшеницы сорта Харьковская 11 через 18 суток после самоопыления исследуют в эксперименте. Отделенные от растений незрелые семена погружают в 0,5 -ный раствор ДМСО на 18, 2 ), 22, 24, 28 ч, а затем в вакуумном эксикаторе дегидратируют над СаС 1 при+3 С. Далее эксперимент проводят аналогично указанному впримере 1. Результаты эксперимента представлены в табл, 2.П р и м е р 3. Растения пшеницы сорта Харьковская 11 через 18 суток после самоопыления исследуют в эксперименте. Отделенные от растений незрелые семена погружают в 0,5 .-ный раствор ДМСО, а затем в вакуумный эксикатор и дегидратируют над СаС 1Таблица 1 Количество суток после самоопыпения Варианты эксперимента 14 16 18 20 22 82 эб Ябэ 4 88 ю 1 85 е 9 84 е 3 Контроль (без обработки) Обработка ДМСО в концентрации, Х:0,10,30,50,75 .1,0НСРО=О, 95 48,8 59, 1 52,1 55,5 56,9 522 62,0 67,4 56,7 61,7 62,9 53,4 47,2 49,1 40,0 44,5 48,7 54,7 52,3 44,6 53,0 53,1 60,2 57,1 41,2 Рс 0,01 Таблнца 2 Жизнеспособность незрелых эмбрионов пшеницы сорта Харьковская 1 1 через 18 суток после самоопыпения, инкубация в О,57.-ном растворе ДМСО,Ж по отношению к контролю Продолжительность инкубацин в ДИСО, ч18 "2) 22 24 28 Варианты эксперимента Контроль (без обработки) 100 100 100 100 100Обработка в 0,52-ном растворе ДМСО 80,6 82,0 86,4 83, 1 70,2НСР з =1,1 Рс 0,01 5 160604в холодильнике при температуре -2,0,;+2, +3, +4, +8 С. Далее экспериментЬпроводят аналогично примеру 1. Ре 1зультаты эксперимента представленыв табл. 3,Как свидетельствуют данные, приведенные в табл. 1 - 3; наилучшие результаты получены при работе с незрелыми эмбрионами через 18 суток после 1 Осамоопыления, которые инкубируют в0,5 Е-ном растворе ДАССО в течение 22 чпри дегидратации в температурном интервале от +2 до +4 С.Для подтверждения эффективности 15способа определяют жизнеспособностьнезрелых эмбрионов пшеницы согласноспособу-прототипу и предлагаемомуспособу после криоконсервации.Сравнительные данные жизнеспособности незрелых эмбрионов после криоконсервации согласно способу-прототипу и предлагаемому способу представлены в табл. 4.Как свидетельствуют данные табл.4,предлагаемый способ более эАЬективен.Выход жизнеспособных незрелых эмбрионов, обрабатываемых по предлагаемомуспособу, превышает выход по способупрототипу на 56 Х. 30Таким образом, претпагаемый способ позволяет увеличивать выход пол 5 бноценных незрелых эмбрионов, необходимых для клеточной селекции, что способствует ускорению работ по селекцииновых сортов растений. Кроме того,способ позволяет осуществлять криоконсервацию незрелых эмбрионов и иххранение на протяжении длительногопериода времени с высоким уровнемжизнеспособности, что имеет важноезначение для сохранения наследственных признаков растений. формула изобретения Способ хранения незрелых эмбрионов пшеницы, включающий их предварительную подготовку, дегидратацию и замораживание, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения жизнеспособности эмбрионов, предварительную подготовку осуществляют путем помещения эмбрионов, взятых на 16 - 20 сут после самоопыления, в 030-0,757-ный раствор диметилсульАоксида на 20 - 24 ч, дегидратацию проводят при температуре +2 - 4 С и замораживание осуществляют путем двух-, этапной криоконсервации сначала в парах, а затем непосредственно в жид-, ком азоте.1606045 Т а б л и ц а 3Жизнеспособность незрелых эмбрионов пшеницы сорта Харьковская 11 через18 суток после самоопыления, инкубация в 0,5 Х-ном растворе ДМСО, 7. Варианты эксперимента оТемпература дегидратации, С-2 ) +2 +3 +4 +8 63,9 84,1 88,0 88,2 88,1 74,3 44,1 61,4 67,4 67,6 67,5 51,3РО,01 Способпрототип Предлагаемый способ Варианты эксперимента Жизнеспособность незрелых эмбрионовпшеницы43,4 (1002) НСР о 95 Составитель В.Демкин Редактор С,Лисина Техред М.Дндык Корректор Н.КорольЗаказ 3504 Тираж 416 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4./5