Способ получения и -субъединиц из лютенизирующего гормона

,ЯО 9 4 С 07 К 13/ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Институт экспериментальнойэндокринологии и химии гормоновАМН СССР(56) Неппеп С., Ргцяйс Е.,Ма 8 Ьц 1 п С. - Нодхягег Рогспе .цГеп 1 эпд Ногшопе апй хгз БцЬцпгз.1 зо 1 айхоп апй сЬагасСегхзагхоп Ецг.Л.Восйеш. 1971, 18, 376-,383.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ к- и-СУБЪЕДНИЦ ИЗ ЛЮТЕНИЗИРУЮЩЕГО ГОРМОНА(57) Изобретение касается полученияприродных веществ, в частности М, - иР-субъединиц (СЕ) из лютенизирующеггормона, которые используют в биологии, медицине и фармацевтическойпромьппленности. Цель - повьппение выхода СЕ и учрощение процесса. Последний ведут пропусканием раствора лютнизирующего гормона из кашалота илибыка в другой смеси растворителей при объемном соотношении н-бутанола,воды и СН СООН (50-60):(25-30):(1520) через колонку с сорбирующей насадкой, в качестве которой используют сефадекс Спри загрузке гориона 1-2 мг на 1 мл сорбента. Элюирование проводят ступенчато, т.е. вымывают Р-субъеднницу указанной смесью растворителей (лучше при объемномсоотношении 10:5:3), а затем аь-субъединицу, но с другим соотношением растворителей, т. е. (0-35);.(50-65):(153" ), преимущественно 2: 4: 1. Затем полученные растворы упаривают, лиофилизируют и проводят гельфильтрациюна сефадексе Сфракции, содержащей К -субъединицу. Способ обеспечивает увеличение выхода с 75 до 967.и позволяет упростить процесс за счетсокращения стадий обессоливания игельфильтрации при исключении использования мочевины и гуанидинхлорида, которые содержат примеси, снижающие биологическую ценность белков,2 з.п. ф-лы, 1 табл.13Изобретение относится к усовершенствованному способу получения ж -и о -субъединиц из лютенизирующегогормона и может найти применение вбиологии, медицине, Фармацевтическойпромьцоленности.Цель изобретения - упрощение процесса и повышение выхода целевогопродукта.Предлагаемый способ благодаря использованию в качестве сорбирующейнасадки сефадекса Си ступенча-того градиента при элюции вначалесистемой н-бутанол - вода - уксуснаякислота, в объемных процентах 50-60;:25-30:15-20 для вымывания ф -субъединиц, а затем системой н-бутанол -вода - уксусная кислота, в объемныхпроцентах 0-35:50-65;15-35 для вымывания 6-субъединиц, позволяет повысить выход целевых продуктов до 96%,вместо 75 в известном способе, атакже упростить процесс, сокративколичество стадий (обессоливание игель-фильтрацию) и исключив использование мочевины или гуаницинхлорида, которые к тому же содержат примеси, снижающие биологическую активность белка,П р и м е р 1. 500 мг ЛГ кашалотарастворяют в 50 мл системы, содержащей н-бутанол, воду и уксусную кислоту в объемном соотношении 10:5:3.в об.Х 50-60:25-30:15-20, Растворбелка вносят в колонку с сефадексоиСтонкий (3,6 25 см), уравновешенную той же системой (нагрузка 1-2 мгбелка намл), скорость элюции 1020.мг/см ч. После выхода первого пика, содержащего р-субъединицу колонку отмывают до исчезновения белка вэлюате и дальнейшую елюцию проводятсистемой с объемныи соотношением компонентов н-бутанол - вода - уксуснаякислота 2:4;1, в об,% 0 - 35:50-65;1535. Скорость элюции 120 мл/ч. Первыйи второй пики собирают раздельно иупаривают на роторном испарителе вовакууме при 35 С до 1/10 исходногообъема. Полученные фракции разбавляют водой и лиофилизируют. Материалывторого пика подвергают гельфильтрации на колонке с сефадексом С в 0,05 М аммоний бикарбонатном буфере, В результате гельфильтрации получают два. пика. Первый пик - белковые примеси (не ЛГ), второи пик содержит в,-субъединицу, Фракции объединяют и лиофилизируют. Выход ф-субь 10403 2единицы 240 мг, М, -субъединицы 220 мг,примесные белки 20 мг. Таким образом,выход субъединиц с учетом примесей96%.П р и м е р 2. 500 мг ЛГ минкеобрабатывают аналогично примеру 1,В.ход -субъединицы ЛГ 215 мг, Ысубъединицы ЛГ 220 мг и примесныебелки 21 мг (87%).П р и и е р 3. 100 мг ЛГ быка обрабатывают, как в примере 1, кромеследующих измерений: белок растворяют в 12 мл исходной трехкомпонентнойсистемы н-бутанол - вода - уксуснаякислота 10;5:3. Размер колонки с сеФадексом С(2,5 15 см). Выход Ы -субъединицы 42 мг,-субъединицы43 мг, примесные белки 6 мг,П р и м е р 4. 50 иг ЛГ кашалотарастворяют в 25 ил системы н-бутанолвода - уксусная кислота 13:4:4 и пропускаот через колонку с сефадексомСобъемом 50 мл, Вторая системаэлюции и прочие условия аналогичныпримеру 1, Выход -субъединицы 15 мг,ж-субъединицы 18 мг.П р и и е р 5, 50 мг ЛГ кашалотарастворяют в 5 мл системы н-бутанол -вода - уксусная кислота 10:5:3 и пропускают через колонку с сефадексомСобъемои 30 мл. М -Субъединицу де"аорбируют системой с соотношениемкомпонентов н-бутанол - вода - уксусная кислота 3:3:2 Остальные условияподобны примеру 1, ВыходЫ, -субъединицы 13 иг,3 -субъединицы 22 мг.Замена сефадекса в качестве сорбента на целлюлозу приводит к уменьшению отношения белок/объем сорбента, а также к замедленио процесса изза большего сопротивления току элюента колонок с целлюлозой.П р и и е р 6. Для разделения100 мл ЛГ кашалота на субъединицыиспользуют колонку с целлюлозой (3,6"х 25 см)р скорость злюции 30 мл/чрпри прочих условиях одинаковых спримером 1, ВыходМ -субъединицы 35 мг,,3-субъединицы 38 иг.Критерием частоты, полученных препаратов М- и ( -субъединиц являетсяих аминокислотный состав. В таблицеприведены данные по аминокислотномусоставу Ж- и 9 -субъединиц ЛГ из гипофизов быка и кита кашалота, полученные при определении аминокислотного состава и аминокислотной последовательности.3 13104Из таблицы видно, что аминовислотный состав субъединиц, полученныхпредлагаемым и известным способами,практически совпадает.Предлагаемый в данном способе ин"тервал нагрузок по белку обусловленследующим. Увеличение (2 мг/мл) соотношения белок/сорбент будет приводить к проскокус 6-субъединицыво Фракцию ф -субъединицы. Чрезмерное уменьшение (1 мг/мл) соотношения белок/сорбент приведет к замедлению процессаи увеличению объема фракций, в которые входят Ж - и -субъединицы,Процесс элюирования фракций Ж- и 15-субъединиц контролируют с помощьюУФ-детектора при 280 нм, объем элюированных Фракций- и Д-субъединицне превышает обычно удвоенного объема нанесения. 20Поскольку сефадексы - сорбенты неприспособленные к работе с противо 1давлением, то обычно используетсяестественная текучесть колонки с сеФадексом, Искусственное замедление 25процесса элюции приводит к уменьшению объема фракций элюирующихся М -и-субъединиц до 1,3 - 1,5 объемананесения, но одновременно увеличивается время разделения. Естественная текучесть колонки длиной 20 см,заполненной сефадексом С(тонкий)в пределах 10-20 мл/см ч,Для элюирования используют систе 35 мы растворителей из н-бутанола - воды - уксусной кислоты. Для первой системы с интервалом для н-бутанола 50-607, для воды 25-30 , а для уксусной кислоты 15-207 Снижение для этой системы содержания бутанола до 507. и ниже, а также увеличение содержания уксусной кислоты до 207 и вьппе приводит в целом к уменьшению сорбционных свойств сефадекса по от ношению к М -субъединице. Это влечет за собой снижение нагрузочной емкости колонки с сефадексом, а еще большее снижение концентрации бутанола или (и) увеличения концентрации уксусной кислоты приводит в конце концов к проскоку М - субъединицы во фракцию -субъединицы. Снижение (в первой системе) содержания воды до 157 и ниже приводит к снижению растворимости белка в первой системе, а увеличение содержания воды до 207, и выше влечет за собой увеличение содержания уксусной кислоты (обусловлено 03 4условием смешиваемости системы) и как следствие к увеличению вероятности проскока М,-субъединицы во фракцию -субъединицы.Состав второй системы допускает большие вариации содержания компонентов. Основные требования предъявляемые к ней: хорошая растворимость в нейп -субъединицы,хорошая смешиваемость с первой системой и отсутствие сорбционных взаимодействий между сефадексом и -субъединицей в этой системе.Снижение во второй системе содержания н-бутанола вплоть до 0% влечет увеличение содержания уксусной кислоты до 357,. В целом смешиваемость первой и второй систем лучше, когда обе системы содержат н-бутанол, кроме того повышение содержания уксус - ной кислоты - это более жесткие нежелательные условия для белка. Содержание воды во второй системе целиком определяется приведенными вьппе тремя требованиями.Формула из обре тенин,1. Способ получения- и В -субъединиц из лютенизирующего гормона, включающий пропускание раствора лютенизирующего гормона в смеси растворителей через колонку с сорбирующей насадкой, элюирование растворителем переменного состава, последующее упаривание, лиофилизацию и гель- фильтрацию на сефадексе Сфракции, содержащей Ж -субъединицу, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса и повьппения выхода, в качестве сорбирующей насадкииспользуют сефадекс С, в качестве растворителя - смесь н-бутанол - вода - уксусная кислота присоотношении, об.7,: 50-60",25-30:15-20 при загрузке гормона из расчета 1- 2 мг на 2 мл сорбента, а элюирование проводят ступенчато с использованием вначале указанной смес растворителей до полного вымывания-субъединицы, затем элюирование проводят смесью н-бутанол - вода - уксусная кислота при соотношении 0-35:50-65:15- -35, об. .2. Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что состав элюента первой ступени н-бутанол - вода - уксусная кислота 10:5:3, об.7,.1310403 6второй ступени н-бутанол - вода - ук-,сусная кислота 2 4:1, об.%,-ЛГ кашалота м -ЛГ кашалота Амино-кисло(1-ЛГ быка М -ЛГ быка Последовательность осле Последовательность ПоследоМ % вательта дова- тель- ность ность 6,3 5,8 6 9,0 8,5 9 5,4 5,8 6 7,9 8,4 8 7 5 6 8 7 4,3 4,8 4 7,0 7,3 7 Асп Тре Сер Глу Про Гли 1/2 Цис 9,2 8,5 10 5,4 5,2 5 3,7 3,7 4 2,0 1,9 2 1,9 1,8 2 Мет 2,2 2,2 2 3,9 3,8 4 3 10,4 10,5 11 5 2,2 2,2 2 5 3,7 3,5 3 3 0,9 0,9 1 3,6 Лей 4,9 5,1 4,9 5,2 3,0 2,8 10,1 10,2 .3,8 3,65,0 5,0 5 Тир 4,9 5,2 5 2,9 3,2 3 10,2 10,3 10 3,0 3,2 3 Фен Гис 10 3 10,8 11,1 11 АргАминокислотный состав субъединиц, полученных известными методами.Аминокислотный состав субъединиц, полученных предлагаемым методом,Составитель В.ВолковаТехред Н. Глущенко Корректор И.Эрдейи Редактор И.Сегляник Заказ 1865/24 Тираж 348 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород,ул.Проектная,4 3. Способ по п.1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что состав элюента1 5,3 5,4 5 6 9 6 8 7 7,3 7,8 8 6,0 6,2 6 19,6 20,3 20 6,7 7,3 7 8,2 7,8 8 10,0 10,4 12 8,0 8,2 82,4 2,7 3 4,4 4,9 5 11,5 11,9 122,0 2,2 2 3,3 3,3 3 28 27 3 2,2 1,8 2 8,0 8,3 8 5,1 5,2 8,4 7,9 6,1 5,8 7,9 8,2 6,4 6,1 5,2 5,1 8 р 3 7 ф 8 8,6 8,5 4,2 4,1 3,6 3,7 5 5,7 5,4 5 8 5 0 4 9 5 6 9,0 8,9 9 8 5,3 5,3 5 6 20,8 20,9 21 5 8,2 8,1 8 8 11,1 10,9 11 10 10,2 10,5 12 4 8,3 8,1 8 4 1,9 1,8 2