Способ выделения микроорганизмов, обладающих полиредуктазными свойствами, из природных субстратов

(1 У И 53999 Е ИЗОБ НИ ОП ВТ(53) (56) у Кузиизмов4. ов С.И.,есных ко анию. ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ КОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ 3774503/28-1320,07,8430.08.86. БюлИнститут микрии АН КазССРА,Н.ИлялетдинС.А.Айткелъди576,8.093.1(0Романенко В.Игия микроорганИ.: Наука, 19включающий получение накопительнойкультуры в анаэробных условиях,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью сокращения времени выделения микроорганизмов - полиредуктантов, после получения накопительнойкультуры осуществляют ее посев нарыбопептонный агар и ведут культивирование в аэробных условиях, после чего выделяют чистые культурымикроорганизмов и проводят их посевна питательные .среды для выявления способности полученных культурк сульфатредукции и нитритообразо,Изобретение относится к областимикробиологии.Цель изобретения - сокращениевремени выделения микроорганизмовполиредуктантов.Сущность способа заключается вследующем, Исследуемую пробу высевают в 3-5 параллельных рядов пробирок, которые затем доверху заливают средой накопления (среда Штурм)и закрывают резиновыми пробками,Среда иаконления имеет следующийсостав дистиллированной воды г/л: Лактат кальцияАммоний сернокислыйФосфат калия,однозамещенныйСульфат магнияСульфат кальцияСоль Мора1 Е-ный растворсульфида натрия 1,0 0,5 1,0 0,5 0,5 1 ил Все выросшие на РПА колонии выделяют в чистой культуре иа скошенный РПА и затеи проверяют их способность к восстановлению нитратов и сульфатов. Суспензвю чистых культур высевают в среду для выращивания Факультативно-анаэробных денитрифицирующих микроорганизмов (среда Гильтая) следующего состава дистиллированной воды, г/л:Аспарагин 0,5 Глюкоза 10,0 Нитрат калия 2,0 Натрий лиммоннд-кислый 2,5Фосфат калил,однозамещенный 2,0 Сульфат магния 2,0 Хлористый кальций 0,2 Хлорное железо Следы Бромтимолблау 0,1 Х Изменение окраски среды от зелено. ватой до синей через неделю инкубации, происходящее при подщелачива-Через 10-14 дней инкубации при6;28 С, когда визуально наблюдают по.ернение среды, свидетельствующее о наличии процесса сульфатредукции, производят посев среды из накопитель. ной культуры в чашки Петри на поверхность рьбопептонного агара (РПА) в 10-20 кратной повторности.нии среды и появление иона 110 - (о чем судят по порозовению среды при добавлении реактива Грисса), свидетельствует о наличии процессе денит рификации.С колонии на РПА делают также посев на агаризованную среду для сульФатредуцирующих микроорганизмов (среду П 1 турм) следующего состава дистиллированной воды, г/л: Лактат кальцияСернокислый аимонийФосфат калия,однозаиещенныйСульфат магнияСульфат кальцияСоль Мора.1%-ный растворсульфида натрияАгар 1,0 0,5 0,5 0,5 0,5 1 мл15-20 Способ поясняется конкретнымпримером.П р и и е р, Из почвы и шахтныхвод местсрождения стерильно отбирают пробы, каждую из которых затем .высевают в 5 пробирок с жидкой срет., дой Штурм для получения накопитель- Ы ной культуры в анаэробных условиях.Количество инокулята составляет 5- 10 от общего объема питательной среды. О развитии процесса сульфатредукции,судят по образованию черныхколоний в толще агаризованной среды.Наличие роста на всех предлагаемых средах с образованием соответствующих восстановленных продуктов(нитрит-иона, газообразного азота,сероводорода) указывает на возможность проявления выделенными культурами микроорганизмов полиредуктазных свойств. С отобранными таким образом штаммаии микроорганизмов провоЗ 5 дят ряд.5-10 кратных перекрестных пересевов на указанные среды в соответствии со схемой.Способность чистых культур микроорганизмов развиваться на всех що предлагаемых средах в течение рядаперекрестных пересевов и осуществлять на соответствующих средах восстановление кислорода, нитратов илисульфатов указывает, что выделенныйштамм обладает полиредуктазными свойствами.Пробирки закрывают резиновыми . пробками так, чтобы в пробирке не осталось пузырьков воздуха и инкуби.оруют в термостате при 28 С. Через 1 О дней, если в пробирке наблюдает ся почернение среды, обусловленное развитием микроорганизмов, восстанавливающих сульфаты с образованием сероводорода, из полученной накопительной культуры делают высев на ры- О бопептонный агар и 5-10 чашек Петри и культивиро.ание ведут в азробных условиях в течение трех суток. В этих условиях происходит гибель всех олигатно-анаэробных микроорганизмов, 5 в частности сульфатредуцирующих бактерий. На чашках Петри обычно вырастает небольшое количество колоний, которые выделяют в чистой культуре на скошенньш рыбопептонный агар 20 Чистые культуры микроорганизмов высевают в 5 пробирок со средой Гильтая для проверки их денитрифицирующей способности и в 5 пробирок в ана- эробные условия на агаризованную среду Штурм. Через 10, дней наличие роста в анаэробных условиях, появление серо 30.водорода на среде Штурм, а также обнаружение нитритов в среде Гильтая свдетельствует о выделении микроор. ганизмов - полиредуктантов, В качестве контроля используют среды, не засеянные микроорганизмами. 35Исследование 50 образцов воды, почвы и руды позволило выделить 4 штаммамикроорганизмов, обладающих полиредуктазными свойствами.Выделенные культуры микроорганизмов были идентифицированы по определению Берги как аэробные формы, относящиеся к семейству Ряецдошопа Йасеае роду Ряецдошопая и видам Ря . я сцтяегт и Ря . шепйос 1 па. Так как 45 культуры отличались от описанных в определителях Берги и Скермана рядом новых свойств, в частности способностью редуцировать сульфаты, к видивому названию культуры было добав дено название варианта чат. Йеяц 1- ГцтсапВыделенные микроорганизмы отличались некоторыми культурально-морфо= логическими свойствами и поэтому 55 были разделены на две группы, в одну из которых вошли штаммы 18 и 26-4, а во вторую - 28 и 39 в. Описание изученных культур микроорганизмов: Ряецдошопая ясцггет 1 чаг,йеяц 1 Гцг 1 сапя 18 - грамотрицательная,подвижная, неспорообразующая палочка, размеры которой 2 " 0,5-0,7 мкм.На РПЛ колонии вырастают округлойформы, диаметром 5-6 мм коричневогоцвета, блестящие, гладкие. Имеют одинжгутик. Оптимальное значение рН впределах 7,2-8,5. Температурный оптимум 25-30"С, но может расти и при42 С. При 4 С роста нет. На мясопеп-.тонном бульоне образует скудныиосадок, слабо выделяет БЯ и Н Б.Протеолитической способностью йеобладает, гидролизует крахмал, молоко не пептонизирует и не гидролизует,Оксидазоположительна. Хемоорганотрофна. Способна расти аэробно на рыбопептонном агаре. В качестве источника азота в аэробных условиях используют мочевину, пептон, асларагин.В качестве единственного источнчкауглерода,в аэробных условиях использует глюкозу, фруктозу, ксилозу,арабинозу, галактозу, сахароэу, мальтозу, декстрозу, глицерин, сорбит,маннит, этанол. Микроаэрофил при росте в аэробных условиях развиваетсяв присутствии органических субстратов, снижающих ОВП среды - мочевины, сульфида натрия,В анаэробных условиях в качествеэнергетического субстрата использует лактат, пируват, ацетат, глюкозу. В присутствии переменновалентных элементов (БО, Ре ь, АяЯО ) растет на глюкозе, ацетате,лактате, пирувате. В отсутствии5+ Л+ионов Ю, Ая , Ре - на лактате,1- пирувате, ацетате, Беэ ионов ЯОрост не наблюдается.1Способна восстанавливать 0,850,94 мг/мл нитратов до 20 мг/млсульфатов. Не может осуществлятьброжение с образованием газообразныхпродуктов в анаэробных условиях вприсутствии глюкозы, Содержание Г+Цв ДНК 62,5 мол,7. Десульфовиридинне обнаружен. Выделен из шахтных водБакырчикского месторождения.Ряецдотопая ягцгкегг чаг, йеяцГцт 1 сапя 26-4 ио большинству показателей выделенный штамм сходен сописанным выше Ря. ягцггегх чаг,йеяц 11 цт 1.сапа 8. Отличительнымиявляются следующие свойства: штамм126-4 имеет размеры 1,5 х 0,4-0,6 мкм.12539 Составитель В.Голимбет Техред И.Попович Корректор М,Макаимишинец Редактор Ю.Середа Заказ 4686/28 Тираж 490 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-.35, Раушская наб д. 4/5Производственно-полиграфическое предприяите, г.ужгород, ул.Проектная, 4 В качестве единственного источника углерода не использует глицерин, декстрозу, сорбит и этанол, Выделен из лечебной грязи озера Балпаш-Сор.РзеМошопаз шепдос 1 па чаг. дезц 1- Гцгсапз 28 - грамположительная, неспорообразующая палочка, имеющая размеры 1 х 0,4-0,5 мкм. На рыбопептонном агаре колонии вырастают беловатые, гладкие, блестящие, округлой 10 формы. Оптимальное значение рН в пределах 7,2-8,5, температурный оптимум 25.-30 С, но может расти и при 42 СПри 4 С роста нет, На мясопептонном бульоне образует плотный 15 обильный осадок, выделяет ЫН и Н Б, протеолитической способностью не обладает,", гйдролиэует крахмал. Расщепляет жиры, свертывает молоко, Оксидазаотрицательна. Хемоорганотрофна. 20 Способна расти аэробно на рыбопептонном агаре. В качестве источника азота в азробных условиях использует мочевину., пептон, аспарагин. В качестве единственного источника угле рода в аэробных условиях использует арабинозу, глюкозу, ксилоэу, рамнозу, фруктоэу, галактозу, сахарозу, лактоэу, рафиноэу, декстрозу, глицерин, сорбитманнит. При росте в аэробных Зо условиях развивается в присутствии органических субстратов, снижающихОВП среды - мочевины, пептона, сульфйда натрия.В анаэробных условиях в качестве энергетического субстрата использует лактат, пируват, глюкозу, ацетат, Независимо от присутствия н среде ионов переменновалеитных металлов (НО, Аз,Ре . БО, ) хо 99 арошо растет в анаэробных условиях нй глюкозе, пирувате, ацетате.Способна восстанавливать 0,87- 0,94 мг/мл нитратов и до 30 мг/л . сульфатов. В среде с глюкозой в анаэробных условиях осуществляет брожение с образованием газообразных продуктов. Содержанке Г+Ц в ДНК 51,7 51,7 мол,7 Десульфовиридин не обнаружен, Выделен иэ шахтных вод Бакырчикского месторождения Рзецдошопаз шепйос 1 па чаг, йезцИцг 1 сапз 39 в- ло большинству признаков выделенная культура микроорганизмов также сходна с Рз. шепйос 1 па чаг. с 1 езц 1 Гцг- сапз 28. Но имеются следующие отли" чительные признаки. Штамм 39 вимеет размеры клеток 1 0,3-0,4 мкм. Вкачестве единственного источникауглерода использует мальтоэу, дульцит и глицерин. Штамм 39 вобладаетслабой протеолитической активностьюи слабо разжижает желатин.Выделен из воды канала ИртышКараганда,Таким образом, предлагаемый способ позволяет выделить в течение 25-30 дней представителей новой группы микроорганизмов, способных в анаэробных условиях восстанавливать ряд переменно валентных элемен тов н расти в аэробных условиях, в то время как, используя общепринятые методы, поиск микроорганизмов - полиредуктактов по проверке всех выросших на РПА колоний микроорганизмов к способности к полире- дукции, может занять неопределенно долгое время.