Способ определения нарушения иммунного статуса

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИРЕСПУБЛИН 1237 15 2 Г 5 0 0 ди ей ордена Лрасногоим. И.МВ,А.Ал н амениеченова ешк У С. Ргасйгс 1976. в 1,. 1., Кохсг апд 1 пппцпе 1 ехез, МагЬцврГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ М/СВИДЕТЕЛЬСТ(71) 1-й Московскийи ордена Трудового Кмедицинский институт(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАРУШЕНИЯ ИММУННОГО СТАТУСА путем сое нения исследуемой пробы, содержащ иммунные комплексы, с фиксированным на твердой фазе С, компонентом комплемента с последующим иммунорадиометрическим выявлением иммуноглобулинов класса 6 в составе комплексов, о т - л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, дополнительно выявляют с помощью двойных антител иммуноглобулины классов А и М и при увеличении количества одного из классов иммуноглобулинов по сравнению с нормой дпределяют нарушение иммуного статуса.й Ю1 12372Изобретение относится к медицинеконкретнее к терапии, и может бытьиспользовано для определения наруше.ния иммунного статуса, назначенияадекватного лечения и контроля5за проводимым лечением.Цель изобретения - повышение точности способа путем выявления с помощью двойных антител одновременно1 яС, 18 А и 1 цМ. 1 ОСпособ осуществляется следующимобразом.Иммунорадиометрическим методомдвойных антител в составе комплексов выявляются иммуноглобулины трехклассов - А, М и С При этом фиксированный на твердой фазе компоненткомплемента взаимодействует с иммунными комплексами с последующим добавлением антител 1-го порядка с активностью к иммуноглобулинам класлзфсов А, М и С и меченных изотопом 1антител 2-го порядка. Наличие иммунных комплексов определяется на основе подсчета процента связавшихся меченых антител 2-го порядка при использовании антител 1-го порядка ккаждому классу иммуноглобулинов - А,М, С, В случае содержания одного иэклассов иммуноглобулинов по сравнению с нормой определяют нарушениеиммунного статуса.П р и м е р 1. Больная К.,19 лет. Диагноз: ревматоидный артрит, серопоэитивный вариант, актив 35ность П (ревматоидный миокардит 7).В течение месяца получала метиндол вдозе до 150 мг/сут в сочетании сплаквенилом, Несмотря на проводимуютерапию продолжала предъявлять жалобы на утреннюю скованность до 2 ч,выраженные боли в суставах. Длядальнейшего лечения появилась необходимость в проведении определениянарушения иммунного статуса. Способ определения нарушения иммунного статуса проводится в,цва этапа.1 этап. Необходимые реактивы и их получение.1) забор, приготовление и хранение пробы осуществляется на основе рекомендаций ВОЗ (3);2) получение С 1 п фракции комплемента из донорской сыворотки;3) набор кроличьих антисывороток к,иммуноглобулинам классов А, М, и С человека (производство НИИ вакцин3-4. 05 2и сывороток, г. Горький) - антитела1-го порядка;4) получение меченых ослиных антител к иммуноглобулинам класса кролика - антитела 2-го порядка: используется ослиная антисыворотка к иммуноглобулинам кролика (производствоНИЭ им, Гамалеи), введение изотопапроизводится с помощью хлорамина;5). згбуферный физиологическийраствор - ЗФР (рН 7,4);6) желатин медицинский;7) этилен,циамин тетрауксусная кислота - ЭДТА (0,01 М);8) полистиреновые пробирки;9) твин 20;10) счетчик -излучений,11 этап. Определение циркулирующих иммунных комплексов,1) разводят Сп фракцию комплемента до концентрации 0,01 г/л вЗФР;2) полученный раствор разливаютпо 1,О мл в 12 полистиреновых пробнорок, инкубация при 4 С 72 ч.3) пробирки промывают 3 раза спомощью ЗФР;4) пробирки заполняют 0,017-нымрастворо л желатина в ЗФР, инкубируют при +20 С 2 ч;5) смешивают 0,1 мл пробы и 0,2 млЭДТА и инкубируют в термостате при37 С 30 мин;б) выливают из пробирок желатин(см. и, 2) и промывают ЗФР 3 раза;7) в пробирки Р 1-б вводят по0,05 мл разведенной пробы (см. п,5)и 0,95 мл 0,057,-ного раствора твин20 в ЗФР, в пробирки7 - 12 - по1,.0 мл 0,057-ного раствора твин 20в ЗФР, инкубируют при 37 С 1 ч;8) пробирки промывают 3 раза ЗФР;9) в пробирки вносят по 1,0 млантител 1-го порядка к 3 классам иммуноглобулинов А, М и С разведенных1:10 в ЗФР, по приведенной в табл,1в дубликатах.А ( МО Таблица 2 0,1 Среднее значение импульсов в минутув дубликатах 10 0,1 0,1 9-10 0,1 11-2 5 аВ 312 Вм 496 572 А Вд1 О) инкубируют при 37 С 1 ч;11) по 1,0 мл антител 2-го порядка разведенных 1:10000 в ЗФР, вносят в чистые пробирки Нф 13 и 14;12) пробирки У 1-12 промывают 3 раза с помощью ЗФР, пробирки 1 13-4 закрывают притертой крышкой;13) подсчитывают активность пробирок на счетчике-излучений;14) результаты определяют по формулам: при использовании антител 1-го порядка к иммуноглобулину класса А; при использовании антител 1-го порядка к иммунноглобулину класса И;с с100 40 при использовании антител 1-го порядка к иммуноглобулину класса С,м сгде В , В и В - количество импульсов в минуту в пробирках с пробой 45 (среднее значение дубликатов при использовании антител 1-го порядка соответственно к иммуноглобулинам клас сов А М и С 1В В , В - количество импуль сов в минуту в пробирках без пробы с одним ЗФР (среднее значение дубликатов) при использовании антител 1- го. порядка соответственно к иммуноглобулинам классов А, М и С 55Т - количество импульсов в минуту в пробирках с добавленными антителами 2-го порядка без последующего 15 4промывания (среднее значение дубЛикатов, пробирки 9 13 и 14 , т.е. общий счет добавляемых антител 2-го поряд-ка.Результаты исследования иммунных комплексов у больной К приведены в табл.2. Условное Пробиркаобозначе- Вние Результаты подсчета процента связывания антител показали: 0,%7. при использовании антител 2-го порядка к иммуноглобулинам класса А: 5,603 при использовании антител 2-го порядка к иммуноглобулинам класса М и 0,87. при использовании антител 2-го порядка к иммуноглобулинам класса С.Полученные результаты указывали на превышение нормы по иммуноглобулину класса М, что свидетельствовало о нарушении иммунного статуса у больной К, т.е. о развитии системных проявлений, в частности о наличии ревматоидного миокардита. Необходи-мо применение глюкокортикоидов.Больной назначали преднизолон в дозе 20 мг/сут. На фоне терапии наблюдалась положительная динамика суставного синдрома, Результаты исследования. через 1 месяц А 0,53,Составитель П,БонарцевРедактор Л.Пчелинская Техред В.Кадар Корректор М.Лароши Заказ 3220/7 Тираж б 60ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб , д,. 4/5 Подписное.Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул,Проектная, 4 5 123 М 1,07., 0,57. позволили начать сни- жение дозы лреднизолона. Отмена проводилась по 2,5 мг в неделю, полностью преднизолон отменили через 2 месяца. Состояние лри выпуске удовлетворительное. Результаты контрольного исследования А 0,57; М 0,5%: С 0,5% свидетельствовали о нормализации иммунного статуса.Данный пример показателен в методическом плане. В составе иммунных комплексов у больной К н наличии преимущественно иммуноглобулин класса М н при использовании известного способа определения был бы получен лож- . ноотрицательный результат, так как им иммуноглобулин С в норме,П р и м е р 2. Больной Д., 39 лет. Диагноз: инфекционно-аллергичес. кая бронхиальная астма, тяжелое гечение, гормональная зависимость, астматический статус. В течение 2 не. дель лечения глюкокортикоидами - внутривенно калельно гидрокортизон по 250 мг/сут и перорально лреднизолон по 25 мг/сут малоэффективно. Состояние больного продолжало оставаться тяжелым. Выявление иммунных комплексов дало следующие результаты, А 1,07., М 1,0%, С 2,0%. Это указало на наличие выраженного нарушения иммунного статуса - аутоиммунный вариант бронхиальной астмы, В план лечения включили циклофосфан 1 ОО мг/сут. После 3 недель лечения наметился положительный клинический эффект, позволивший начать снижениепредннзолона. Контрольное исследование: А 057.; М 0,57.; С 1,5%.П р и м е р 3. Больная Р., 2 блет. Диагноз: системная красная волчанка люпуснефрит, хроническое течение, активность П, При поступлении получала предниэолон 25 мг нсутки. Выявление иммунных комплек О сов: А 07, М 0,37., С 1,57. Результаты указывают на незначительноепревышение нормы по иммуноглобулину класса б, что в сочетании с нормальным уровнем других классов сви детельстнонало о низкой напряженности аутоиммунного процесса и служилопоказанием к снижению дозы преднизолона. В течение 2 месяцев доза была снижена до 1 О мг в сутки, КонтМ рольное исследование: А 0%; М 0,37,С 1,0 нормализация иммунного статусаВ случае использования известногоспособа у данной больной была затруднена интерпретация результатон только ло нммуноглобулину класса С, таккак нельзя исключить наличие иммунных комплексов с классами А и М. Толь ко на основании имеющихся данных М по трем классам можно полагать незначительный характер имеющихся нарушений иммунного статуса,Предложенный способ позволяет выявить н составе иммунных комплексов З три кла.сса иммуноглобулинов - А, Ми С и с высокой точностью определитьнарушение иммунного статуса.