Способ выделения лимфацитов и гранулоцитов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛ ИСТИЧЕСНРЕСПУБЛИК А 3(51) А 61 В 10 ПИС ИЗОБРЕТЕН СВИДЕТЕЛЬСТ АВТОР К ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(56) 1. А. Воуцгп. 1 ю 1 а(1 оп о 1 угпрЬосу 1 ев,ртапц 1 осу 1 ез апд гпасгортадев Бсапд., 2 пцпцпо 1, 1976, ч. 5 5.(54) (57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИМФОЦИТОВ И ГРАНУЛОЦИТОВ путем центрифугирования дефибринированной крови в градиенте плотности и отбора целевых продуктов с последующей их очисткой, отличающийся тем, чтос целью упрощения способа, в качестве градиента плотности используют раствор природного полисахарида из стеблей Асеа говеа в концентрации 1 - 2% и подконтрастного препарата типа верографина.Изобретение относится к медицине, в частности, к иммунологии, и касается выделения лимфоцитов и гранулоцитов из периферической крови,Известен способ выделения лимфоцитов и гранулоцитов путем центрифугирования дефибрилированной крови в градиенте плотности фиколл - верографин, причем выделение гранулоцитов следует за выделением лимфоцитов и характеризуется большой примесью эритроцитов в гранулоцитарной взвеси 1.Однако известный способ сложен, трудоемок и длителен в исполнении.Цель изобретения - упрощение способа, Указанная цель достигается тем, что согласно способу выделения лимфоцитов и гранулоцитов путем центрифугирования в градиенте плотности и отбора целевых продуктов с последующей их очисткой, в качестве градиента плотности используют раствор природного полисахарида из стеблей А 1 сеа гозеа в концентрации 1 - 2% и подконтрастного препарата типа верографина,Способ осуществляют следующим образом.К 1 - 2 О/о-ному раствору полисахарида добавляют 76%-ный раствор верографина или 80 О/о иодомидаили иодомида. Плотность смеси должна быть в пределах (1,75+ 0,001) 10 кг/м. На 1 объем градиента плотности наслаивают равный объем дефибринированной крови, Пробирки центрифугируют 20 мин при 2000 об/мин и температуре 18 С. После центрифугирования пастеровской пипеткой отсасывают верхнее кольцо, в котором находятся лимфоциты, и отдельно нижнее кольцо, состоящее из гранулоцитав, В полученных взвесях клеток лизируют эритроциты раствором 0,83 О/о-ного хлористого аммония, после чего клетки дважды отмывают раствором Хенкса.Пример 1. Готовят градиент плотности путем смешивания 1 О/о-ного водного раствора полисахарида, выделенного из стеблей Асеа гозеа, и 76% раствора верографина до 1= (1,075 й 0,001) 10 кг/см, плотность жидкости контролируют весовым методом, В пробирку наливают 4 мл градиента плотности и наслаивают 4 мл дефибринированной крови, полученной путем вено- пункции. Пробирку центрифугируют при 2000 об/мин и 18 С 20 мин. При этом образуется на границе двух фаз тонкое и плотное кольцо, представляющее собой лимфоциты, а под ним - второе кольцо, более широкое и рыхлое, представленное гранулоцитами. С помощью пастеровской пипетки осторожно отбирают сначала верхнее кольцо, а затем отдельно нижнее. К взвесям клеток добавляют по 10 мл 0,83 О/,-ного хло. ристого аммония для лизиса примеси эритроцитов и через 10 мин центрифугируют при 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1500 об/мин в течение 1 О мин. Центрифугат удаляют, а клетки дважды отмывают раствором Хенкса.В выделенных взвесях производят подсчет количества клеток в камере Горяева. Определяют процентный выход лимфоцитов и гранулоцитов их жизнеспособность (по трипановому синему) и находят процентное содержание примесей в каждой взвеси клеток. Кроме того, определяют функциональную активность выделенных лимфоцитов в лимфоцитотоксическом тесте (10 опытов) и в реакции розеткообразования (РОК) (15 опытов).Результаты изучения свойств клеток, выделенных с помощью предлагаемого способа, показали, что процентный выход лимфоцитов составляет в среднем 45 О/ грануло. цитов - 65 О/О. Во взвеси лимфоцитов примесь гранулоцитов и эритроцитов составляет не более 10/о. В гранулоцитарной взвеси примесь эритроцитов составляет не более 5 /о, лимфоцитов - не выше 20/о. Жизнеспособность лимфоцитов и гранулоцитов составляет 90 - 100/о.Исследование фенотипа лимфоцитов, выделенных из крови стандартных доноров на градиенте плотности 1 О/О-ный полисахарид + верографин и фиколл+ верографин методом иммунологического типирования в лимфоцитотоксическом тесте показывает совпадение результатов в ООО/, случаев.Результаты сравнительного изучения Т и В-лимфоцитов, выделенных известным и предлагаемым способом, представлены в табл.Представленные результаты свидетельствуют о том, что функциональная активность лимфоцитов, выделенных с использованием градиента плотности на основе 1 О/о раствора полисахарида, не отличается от розеткообразующей способности лимфоцитов, полученных с помощью раствора фиколла.Пример 2. Готовят градиент плотности смешиванием 2 О/,-ного водного раствора полисахарида из стеблей А 1 сеа гозеа и 76/,-ного раствора верографина до р = (1,075 + 0,001) 10кг/Мф (контролируется взвешива. нием). В пробирку наливают 4 мл градиента плотности и наслаивают 4 мл дефибринированной крови, полученной путем вено- пункции. Пробирку центрифугируют при тех же условиях, что и в примере 1. В результате центрифугирования в пробирке образуется тонкое и плотное кольцо, содержащее лимфоциты, и под ним второе кольцо - более рыхлое и широкое, содержащее гранулоциты. С помощью пастеровской пипетки осторожно отбирают сначала верхнее кольцо, а затем нижнее. К взвесям клеток добавляют по 10 мл 0,83/,-ного раствора хлорстого аммония для лизиса эритроцитови через 10 мин центрифугируют при 500 об/ /мин в течение 10 мин. Центрифугат удаляют, а клетки дважды отмывают раствором Хенкса. В выделенных взвесях определяют процентные выходы клеток, оценивают их свойства, теми же методами, что и в примере 1.Результаты оценки характеристик клеток, выделенных с помощью 2 о/о-ного раствора полисахарида, с верографином, показывают, что выход лимфоцитов составляет 50/о, а гранулоцитов - 70 о/о. Примеси гранулоцйтов и эритроцитов в лимфоцитарной взвеси составляют не более 10 о/о. В гранулоцитарной взвеси примеси эритроцитов не более 5 о/ лимфоцитов 15 - 20%. Жизнеспособность клеток в среднем составляет 95 о/оИсследование фенотипа лимфоцитов, выделенных из крови 20 стандартных доноров с помощью градиента плотности: 2/о полисахарид + верографин и раствор фиколла+ верографин методом иммунологического типирования в лимфоцитотоксическом тесте показало совпадение результатов в 100 о/о случаев.Сравнительное определение Т и В-лимфоцитов, проведенное методом розеткообразования, показало, что функциональная активность клеток, выделенных с использованием 2 о/о-ного раствора полисахарида, не отличается от розеткообразующей способности лимфоцитов, полученных центрифугированием в градиенте плотности фиколл+верографии (таблица 2).Для приготовления градиента плотности применяют полисахарид из стеблей шток- розы розовой (А 1 сеа гозеа), полученный в лабораторных условиях Ботанического института им. В. Л. Комарова АН СССР. Полисахарид представляет собой смесь кислого (состав: пентозы, гексозы и уроновые кислоты) и нейтрального (типа глюкана) полисахаридов.В настоящее время разрабатывается нормативно-техническая документация (регламент и ТУ), необходимая для организации выпуска градиента плотности в качеетве диагностического реактива.Предлагаемый способ одномоментного выделения гранулоцитов и лимфоцитов внедрен в иммунологической лаборатории ЛНИИ и ГиПК.Для выявления запредельных параметров, при которых положительный эффект 5 10 15 20 25 30 35 40 45(наличие двух колец) не может быть достигнут, проводились следующие эксперименты. Готовили градиент плотности путем смешивания 0,5, 0,75, 2,25, 2,5/о-ного водного раствора полисахарида и 76 о/о-ного раствора верографина до у - 1,075-0,001/1 Окг/см о. Плотность жидкости контролируют весовым методом. В пробирку наливают 4 мл градиента плотности и наслаивают . 4 мл дефибринированной крови, полученной путем венопункции.Установлено, что 2,25 и 2,5 о/о-ные растворы полисахаридов в связи с высокой вязкостью создают трудности для приготовления точных по плотности растворов, что не дает возможности использовать их в дальнейшей работе.При исследовании растворов полисахаридов низкой концентрации (0,5 и 0,75) не наблюдается желаемого эффекта - образование двух колец.Поэтому для выделения лимфоцитов и гранулоцитов рекомендуется использовать 1 - 2 о/,-ный раствор полисахарида.Предложенный способ выделения лимфоцитов и гранулоцитов заметно упрощает процедуру получения взвесей клеток, так как благодаря одномоментному получению двух видов клеток исключается многостадийность процесса их выделения.На первом этапе на градиент плотности фиколл+ верографин (по прототипу) наслаивают дефибринированную кровь, разведенную физиологическим раствором 1:1, а на градиент плотности полисахарид+ верографин наслаивают неразведенную дефибри ни рова нную кровь.Отличием 11 этапа является разница во времени центрифугирования и в количестве оборотов (500 об/мин - 30 мин и 2000 об/мин - 20 мин.).На 111 этапе при центрифугировании на градиенте плотности фиколл+ верографин образуется только одно кольцо, представленное лимфоцитами. При центрифугировании на градиенте плотности полисахарид+ верографин образуется одномоментно два кольца: верхнее - лимфоциты, нижнее - гранулоциты, Это дает возможность на последующих этапах (1 У и У) получить более чистые взвеси гранулоцитов: примесь эритроцитов в гранулоцитарной взвеси при использовании предлагаемого способа составляет 5 - 10/ а общепринятого 10 - 20%.1123645 Таблица 1 Тп Тг Вс,Г н 7-ный раствор полисахарида + верографин 34,1+0,8 45,3+2,0 31,2+2,1 45,2+2,4 5,3+1,0 15,7+1,8 13,3+1,8 5,0+0,6 Фиколл + верографин ПримеРОК -Та Тт Вс Таблица 2 Гранос Вс 27.-ный раствор полисахарида + верографин 44,5+2,5 5,8+0,9 35,2+1,9 31,2+2,1 17,7+1,8 13,3+1,8 45,2+2,4 5,0+0,6 Фиколл + верографин ВНИИПИ Заказ 8033/5 Тираж 687 Подписноефилиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ч ание:розеткообразующие клетки.Т-субпопуляция лимфоцитов, характеризующаяся наличием 1 о, антигена на поверхностной мембране, который определяет способность клеток к спонтанному образованию розеток с эритроцитами барана.Т-субпопуляция лимфоцитов, характеризующаяся отсутствием 1 о анти- генов и неспособностью к спонтанному розеткообразованию,В-субпопуляция лимфоцитов, характеризующаяся наличием на поверхностной мембране рецепторов для Г, - фрагмента иммуноглобулина, что обусловливает способность этих клеток к образованию розеток с эритроцитами барана, несущими фиксированные молекулы 1.В-субпопуляция лимфоцитов, характеризующаяся наличием на поверхностной мембране рецепторов для с компонента комплемента, обусловливающего образование розеток с эритроцитами барана, имеющими молекулы С - компонента комплемента.