Способ выделения микроорганизмов из суспензий

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 0% (И) за) С 12 Я 7 00 ГОсудАРстВенный номитет сссРпо делдм изоБРетений и отнРытий Ф"- юОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 13 К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54)(57) 1. СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ИЗ СУСПЕНЗИЙ путем пропуска(21) 3455610/28-13(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов(56) 1. Заявка Японии Кф 53-62891,кл, 36(2) С 1, 05.06.78.2. Соуа 1 Банаг М., Напззеп Нецгу,СегЬа СЬаг 1 ез Р. - Бппр 1 е вегпод гоггЬе сопсепггаг 1 оп оГ дпГ 1 цепза ч 1 гцзагою а 11 апго 1 е г 1 игс 1 оц щ 1 сгорогоцзЕ 11 сегз, Арр 1, апд Епч 1 гоп М 1 сгоЬ 1 о 1 ояу. 1980, 39, Ф 3, 500-504 (прототип). ния исследуемого материала над мембраной, сорбции и последующей десорбции микроорганизмов, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения сохранности биологической активности целевого продукта, суспензию пропускают над поверхностью мембраны со скоростью тангенциального потока 0,1- 20 см/с при перепаде давления на мембране 0,01-1,0 мПа, после сорбции микроорганизмов жидкую фазу удаляют и микроорганизмы десорбируют с помощью тангенциального потока буферного раствора при скорости 20-200 см/с и отсутствии перепада давления на мембране или периодической подачи на мемб- рану импульсов отрицательного давления длительностью 0,01-100 с с интервалом между импульсами 0,1-100 с.2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью ускоре- д ния десорбции, поток буферного раствора барботируют.1 вай1 1106Изобретение относится к микробиологии и вирусологии и касается выделения микроорганизмов из суспензий,Известен способ разделения биологических суспенэий с помощью процессов фильтрации через пористые мембра"ны 13,Однако пористая мембрана закупоривается крупными частицам , задерживает фильтрацию мелких частиц, чтоснижает производительность этогоспособа.Известен также способ выделениямикроорганизмов из суспензий путемпропускания исследуемого материала15над мембраной, сорбции и последующейдесорбции микроорганизмов 2 3.Однако известный способ не обеспечивает высокой сохранности биологической активности целевого продукта.20Целью изобретения является повышение сохранности биологическойактивности целевого продукта.Поставленная цель достигается тем,что согласно способу выделения микроорганизмов из суспензий путем пропускания исследуемого материала над мембраной, сорбции и последующей десорбции микроорганизмов, суспенэию пропускают над поверхностью мембраны со30скоростью тангенциального потока О, 120 см/с при перепаде давления намембране 0,01-1,0 мПа, после сорбциимикроорганизмов жидкую фазу удаляюти микроорганизмы десорбируют с помощьютангенциального потока буферногораствора при скорости 20-200 см/с иотсутствии перепада давления на мембране или периодической подачи намембрану импульсов отрицательногодавления длительностью 0,01-100 с40с интервалом между импульсами 0,1 -100 с.Кроме того, с целью ускорениядесорбции, поток буферного раствора45барботируют.Способ осуществляют следующим образом,Биологическую суспензию (БС) пропускают над обычными мембранами соскоростью тангенциального потока50(вдоль поверхности мембраны) 0,120 см/с и перепаде давления на мембране 0,01-1 мПа за счет гидродинамических сил, обусловленных потокомчерез поры, крупный компонент удержи вается на поверхности мембраны, вто время как мелкий компонент частично фильтруется через пори и частично 833 2уносится тангенциальным потоком. Для полноты осаждения крупного компонента раствор, прошедший через фильтрующий аппарат, рециркулируют (возвращается в исходную емкость) в течение 1-3 ч, После завершения процесса посадки часть раствора, содержащую мелкий компонент, сливают, а частицы крупного компонента десорбируют буфером с рН в пределах 6,5-7,5. Для этого поток фильтрата перекрывают, тем самым прекращается действие давления жидкости на крупный компонент БС.Для полноты смыва скорость тангенциального потока буфера увеличивают до 20-200 см/с. Время элюции 1030 мин. Проведенные эксперименты показали, что более эффективная посадка крупного компонента дос:игается при предварительной очистке исходной БС на Фильтре Петрянова, а смыв этого компонента облегчается при применении барабана (введение в буфер пузырьков газа - азот, воздух), Обнаружено также, что повышение скорости фильтрации и прохождения мелкогокомпонента в Фильтрат достигаются в том случае, если на мембрану подаетсяне посто.нный, а пульсирующий перепад давления.Оптимальные результаты достигаются при длительности действия импульсов О, 1-100 с и промежутков междуимпульсами 0,1-100 с. Импульсы давления могут подаваться как в направлении Фильтрации, так и обратно ему.П р и и е р 1, Фильтрация проиэводится по схеме, в которой используется фильтрационный модуль типа "фильтр- пресс" с рабочей поверхностью 3760 смМодуль укомплектован ацетатцеллюлоэными мембранами со средним радиусом пор 1000 А (мембраны "Биопор" производства ВНИИОЧБ). В качестве БС используется вируссодержащая аллантоисная жидкость (ВАЖ) с. вирусом А 2 (Техас). Скорость тангенциального потокафильтруемой жидкости на стадии посадки 20 см/с, йр = 1 МПа. Смыв вирусных частиц после посадки на мембраны осуществляется 0,5 М тряс-буфером, РН = 7,2 при скорости потока буферного раствора 200 см/с. Процесс посадки вируса проводится в течение 3 ч, Исходный объем ВАЖ 000 мл. Титр РГА/0,2исходной ВАЖ 1:1024, содержание белков 2000 мкг/мл (по Лоури), Конечный объем концентрата (послепосадки и смыва буферным раствором, 1106833время смыва 30 мин) 400 мл, титр РГА/0,2 концентрата 1:16000, содержание белков 2000 мкг/мл. Сохранение активности вируса (в процентах к исходной ВАЖ) 1007 Увеличение удельной 5 активности (по отношению к исходной ВАЖ) 1 О раэ.П р и м е р 1 а. Приборное оформление опыта такое же, как и в примере 10Фильтрационный модуль укомплектован мембранами "Биопор" со средниморадиусом пор 1000 А. Биологическая суспензия - вирус Ньюкасловской болезни (ВНБ). Исходная активность 15 А = 7,5 1/мл. Исходный объем БС 5000 мл. Посадка проводится в течение 2,5 ч при скорости тангенциального потока БС 0,07 см/с, йр = 0,01 МПа. Смыв вируса после посадки на мембра не осуществляется 0,05 М трис-буфером, рН = 7,5, при скорости 20 см/с. Конечный объем концентрата (после посадки и смыва) 490 мл. А концентрата 35 1/мл, А фильтрата 40 1/мл. Злект ронная микроскопия показывает наличие большого количества вирусных частиц в фильтрате. Сохранение активности вируса 47%.П р и м е р 2. Приборное оформле ние опыта такое же, как и в примере 1.Фильтрационный модуль укомплектовывается мембранами "Буопор" со средним радиусом пор 2000 А. Биологическая суспензия Беггаса вагсезсепз штамм В, М, число клеток 3 10 1/мл, активность по ферменту (эндонуклеазе) 2000 1/мл (эндонуклеазная активность А определяется методом Мак-Карти). Посадка проводится в те О чение 3,5 ч при скорости тангенциального потока фильтруемой жидкости 100 см/с, д р = МПа, Скорость смыва клеток после посадки на мембрану 200 см/с при рН = 6,5. Исходный объем 45 БС 4000 мл. В обесклеточенной жидкости А 2000 1/мл, а электронная микроскопия показывает практически полное отсутствие клеток. Сохранение эндонуклеазной активности 100%.50П р и м е р 3, Приборное оформление опыта такое же, как и в примере 1.Фильтрационный модуль укомплектовывается мембранами Биопор" со средоним радиусом пор 1000 А. Биологическая суспензия - вирус Ньюкасловской болезни (ВНБ). Исходная активность А = 7,5 1/мл (А определяется по максимальному разведению при кратности1: 10, обеспечивающей 50% - гибель10-ти дневных куриных эмбрионов) .Исходный объем БС 3500 мл. Посадка проводится в течение 3 ч при скорости тангенциального потока БС0,1 см/с, йр = 0,01 МПа. Смыв вирусапосле посадки на мембране осуществляется 0,05 М трис-буфером, рН = 7,5,при скорости 20,0 см/с. Конечный обьемконцентрата (после посадки и смыва)400 ил, А концентрата 70 1/мл, Афильтрата 1 1/мл. Электронная микроскопия показывает отсутствие вирусав фильтрате. Сохранение активностивируса 1007П р и м е р4Приборное оформле"ние опыта и тип БС такой же, как ив примере 1. Начальный объем БС4000 мл, фильтруется через слойфильтра Петрянова со средним размером пор 1-1 О мкм. Титр РГА послетакой предфильтрации полностью сохраняется, содержание белков сохраняется. Время посадки 2,5 ч. Содержание белка в концентрате (после посадки и смыва буфером - условия опыта такие же, так и в примере 1)2000 мкг/мл, титр РГА/0,2 концентрата 1:16000. Сохранение активностивируса 1007.П р и м е р 4 а. Приборное оформление опыта, мембраны и тип БС такойжс, как и в примере 1 а. Начальныйобъем БС 5000 мл. Исходная активностьА = 7 1/мл. Посадка проводится втечение 2 ч при скорости тангенциаль,ного потока БС 22 см/с, д р = О, 01 МПа .Смыв вируса после посадки на мембраныосуществляется 0,05 М трис-буфером,рН = 7,5, при скорости 20 см/с. Конечный объем концентрата (после посадкии смыва 500 мл. А концентрата 401/мл, А фильтрата 30 1/мл.Электронная микроскопия показываетналичие большого количества вирусныхчастиц в фильтрате. Сохранение активности вируса 577.,П р и м е р 5. Приборное оформление опыта и биологическая суспензиятакая же, как в примере 1. Однако влинию фильтрата подключается перистальтический насос с одним роликом. Направление вращения - навстречу потоку фильтрата. В результате периодически (половина времени полного оборота)создается давление в зоне фильтрата,превышающее давление над фильтрующеймембраной и, как следствие, поток изСоставитель А. МаныкинРедактор Г. Волкова Техред О,Неце Корректор Д. Мельниченко Заказ 5724/20 Тираж 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 5 1106833 Ьзоны фильтрата проходит сквозь мембра- как и в примере 1, только в процессену в зону концентрата, смыва буферный раствор перемешиваетсяТаким образом, решаются две зада- с пузырьками газа (воздух, азот) вчи - очистка пор мембран от примесных объемном соотношении 50 ,частиц (белков) и облегчается смывВремя смыва 10 мин. Титр РГА/0,2крупнодисперсных частиц (вируса) с концентрата 1: 16000, содержание белковповерхности мембраны. Программное 2000 мкг/мл. Выход по РГА (в проценустройство, управляющее работой на- тах к исходному ВАЖ) 100 . Увеличениесоса, позволяет осуществить время удельной активности (по отношению кдействия импульсов давления в диапаэо исходной ВАЖ) 10 раэ. Сохранение акне 0,1-100 с и периодичность следо-тнвности вируса 100 .вания импульсов 0,1-100 с,Результаты концентрирования такие Предлагаемый способ очистки концентже как и в примере 1, Однако, если рирования позволяет сохранить 100 в примере 1 проницаемость по воде 15 биологической активности выделяемыхмембраны в фильтрующем аппарате падает частиц при степенях концентрированияот опыта к опыту в 1,5-2 раза от пре" до 20-25 раэ при отсутствии концентридыдущей, то в этом случае она практи- рования белка, работать при испольэочески остается неизменной. ванин широкого класса мембран, диаметрСохранение активности вируса 100 . 20 пор которых подбирается исходя из усП р и м е р 6. Приборное оформле- ловия полного задержания крупнодисние, тип БС и условия опыта такие же, 1 персных частиц.1