Проточный цитофлуориметр

(56) 1, Ооиае И. АцСоваС 1 оп о 1 суСоб 1 цоговеСгу Ьу цве оГСЬе 1 врц 1 вв 1 сгорЬЬСошеСег,-,"Р 1 цогевсепсеСесЬп 1 сцев 1 п се 11 Ь 1 о 1 обу" брг 1 пбег чег 1 аб, Вег 11 п - СесЬп 1 сцев1 п се 11 Ь 1 о 1 оау.2. Огау ,У. еС а 11 б 11 С бсац11 оч суСошеСгу о 1 вавша 11 ап сЬгововошев.ЮН 1 вСосЬев ап 6 СуСосЬеш1979 Ч27 9 1 рр 441 444З.Ь 1 пбво Т апй бСееп Н.В. СЬагасСег 1 вС 1 ев о 1 а в 1 вр 1 е Ь 1 ВЬ - гево 1 цС 1 оп Ыом суСошеСег Ьавей оп а1пем 11 ом соп 11 яцгаС 1 оп. В 1 орЬув Ю,1979, Ч 28, 9 1; рр. ЗЭ-. 34 (прототип) . 43Я.Барский,Ю,М.Розанов УДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СС ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬ ПИСАНИЕ ИЗ Г 54) (57) ПРОТОЧНЫЙ ЦИТОФЛУОРИИЕТР, содержащий флуоресцентный микроскоп, форсунку для подачи и гидродинамической фокусировки жидкости с исследуевми клетками, покровное стекло микроскопа, систему для отвода жидкости с клетками, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью ,повышения точности и,производительности измерений, форсунка размещена поч покровным стеклом, а система отвода жидкости с клетками выполнена в виде полости смачиваю- щегося материала, прикрепленной к нижней поверхности покровного стек,ла под объективом микроскопа, причем для обеспечения стационарного потока жидкости с клетками расстояние от края пятна жидкости на покров ном стекле до места прикрепления полости составляет величину 0,5- 1,0 от ширины пятна.Изобретение относится к технической Физике, а именно к аналитической микроскопии, в частности к приборам для биологии и медицины, и наиболее эффективно может быть использовано для скоростного автоматического анализа содержания. клеточных компонентов и изу- . чения их физико-химического состояния путем измерения флуоресцент- ных характеристик большого числа отдельных клеток.Известен проточный цитофлуориметр на базе флуоресцентного мик, роскопа, предназначенный для автоматической регистрации флуорес центных параметров отдельных клеток в составе, клеточной суспензии со скоростью измерения до нескольких тысяч клеток в секунду, В этом приборе взвесь исследуемых клеток пос тупает из капилляра в проточную камеру, расположенную на предметном столике микроскопа и проходит е током жидкости в горизонтальном направлении с большой скоростью через поле зрения микрообъектинаВ момент прохождения клетки перед микрообъективом, сфокусированном на определенную плоскость, осуществляется освещение клетки возбуждающими лучами от источника света 1 на выходе датчика излучения фотометрической насадки Формируется импульс, амплитуда которого пропорциональна интенсивности флуоресценции. Система регистрации проводит анализ амплитудного . распределения импульсов и выдает гистограмму распределения клеток ,по интенсивности их свечения. Стаби,лизация положения горизонтального потока клеток при их прохождении 40 в поле зрения объектива осуцествляется с помощью гидродинамической фо.-кусировки: в камере под давлением создается горизонтальный ток жидкости, в центре которого распола гается капилляр с исследуемыми . клетками 13 и 21 10 Недостатком указанного прибора является малая стабильность положения клеток относительно объектива, в результате чего клетки выходят эа пределы глубины резкости микрообъектива, что приводит к уменьшению точности измерения. Другим недостатком прибора является невозможность использования в нем высокоапертурных иммерсионных объективов, имеюцих обычно малое рабочее состояние, не позволяющее сфокусироваться на измеряемые клетки через стенку ка меры и слой жидкости, находящийся , перед клетками.Наиболее близким по технической суцности к предлагаемому является проточный цитофлуориметр, со 65 держащий Флуоресцентный микроскоп, Форсунку для подачи и гидродинамичной фокусиронки жидкости с иссле дуемыми клетками, покровное стекло микроскопа, систему для отвода жид-. кости с клетками. В этом устройстве стабильный горизонтальный поток клеток н плоскости Фокусиронки инвертированного микроскопа.обеспечивается гидродинамической фокусировкой клеток н струе жидкости, падающей. под углом на верхнюю поверхность покровного стекла и собираемой с него с помощью отсасываю- щего насоса 3Недостатком этой конструкции прибора является невозможность использования в нем обычных неиннертированных ) флуоресцентных микроскопов, которые н частности комплектуются светосильными высокоапертурными иммерсионными микрообъектинамй, необходимыми для точных Флуориметрических измерений Другим недос-. татком известной конструкции является необходимость использования н ней принудительного с помощью насоса) отвода жидкости с клетками со дна,камеры, что усложняет конструкцию камеры и понижает надежность и точность измерения и удобства ееэксплуатации.Целью изобретения является повышение точности и производительности измерений.Для достижения цели в проточном цитофлуориметре, содержащем флуоресцентный микроскоп, Форсунку для подачи и гидродинамической Фокусировки жидкости с исследуемыми клетками, покровное стекло микроскопа, систему для отвода жидкости с клетками, Форсунка размецена под покронным стеклом, а система отвода жидкости с клетками выполнена в виде полости смачиваюцего материала, прикрепленной к нижней поверхности по- кровного стекла под объективом микроскопа, причем для обеспечения стационарного потока жидкости с клетками расстояние от края пятна жидкости на покронном стекле до места прикрепления полости составляет величину 0,5-1,0 от ширины пятна.На чертеже показана принципиальная схема проточного цитофлуориметра.Проточная камера состоит из корпуса 1 и размещенной в ней Форсунка 2, Вдоль осй Форсунки расположен капилляр 3, по которому подается суспензия клеток, Корпус Форсунки имеет патрубок 4 для подачи воды в Форсунку. На корпусе камеры закрепляется покровное стекло 5. Полоска смачивающегося материала б закрепляется в верхней части корпуса камеры и касается нижней поверхности10 15 20 25 30 35 40 45 покровного стекла. В нижней части корпуса камеры имеется патрубок 7 для стока воды. Проточная камера крепится на предметном столике 8 флуоресцентного микроскопа. Функциональная схема проточного цитофлуориметра включает микрообъектив 9, источник 10 света, коллектор 11, полевую диафрагму 12, светофильтры 13 для выделения возбуждающего света, светофильтр 14 для выделения света Флуоресценции, интерференционную светоделительную пластинку 15, Фотоэлектронный умножитель 16, спектрометрический усилитель 17, многоканальный анализатор 18 импульсов.Проточный цитофлуориметр работает следующим образом.Суспензия клеток, предварительно меченых Флуоресцирующим краси.телем, подается с постоянной скоростью в центральный капилляр 3 форсунки 2. Одновременно через пат рубок 4 в форсунку под давлением 0,6-0,8 атм поступает вода, которая обтекает центральный капилляр 3, при этом за счет гидродинамической фокусировки клетки в суспензии выстраиваются вдоль оси форсунки. Таким образом, формируется ламинарная коаксиальная струя диаметром 150 мкм, вдоль.оси которой выстраиваются клетки суспензии. Эта струя, несущая клетки, направляется снизу вверх под углом 60-70 она нижнюю поверхность покровного стекла 5.В месте падения на покровное стекло струя распюцощивается и образует пятно эллипсовидной формы, длина и ширина которого зависят от внутреннего диаметра форсунки, ,угла падения струи на покровное стекло и давления подачи жидкости, На определенном расстоянии от края пятна по току жидкости .(0,5-1,10 от ширины пятна) прикрепляется полоса смачивающегося материала 6, с помощью которой жидкость с клетками самотоком стекает с покровного стекла на дно камеры и затем через патрубок.7 удаляется из нее. Расстояние, на котором прикрепляется полоска 6, достаточно для того, чтобы было исключено возникновение значительной турбулентности при ударе жидкости о полоску, и в то же время это расстояние не слишком велико, иначе на нижней поверхности покровного стекла до полоски будет равномерный ток жидкости. Для обеспечения стационарного потока жидкости расстояние от края пятна жидкости на покровном стекле до местаприкрепления полоски должно составлять величину 0,5-1,0 от шириныпятна, что при диаметре выходногоотверстия форсунки 150 мкм, углепадения жидкости на покровное стекло 60-70 и давлении подачи жидкости0,6-0.,8 атм соответствует 1-2 мм иобщему расстоянию от места цадения струи до места прикрепления полоски смачивающего материала 3-4 заи. Приэтом в поле зрения микрообъектива9 формируется стабильный поток клеток. Во время нахождения клетки впосле зрения объектива возбуждаетсяфлуоресценция красителя, связанногос определенным внутриклеточным веществом (например, ДНК, белком).Источником возбуждающего флуоресценцию света является ртутная лампа 10.Свет от нее собирается коллектором11 и при помощи интерференционнойсветоделительной пластинки 15 направляется через микрообъектив 9 на исследуемые клетки. Светофильтры 13 и14 выделяют полосы возбуждения и Флуоресценции соответственно. Фотоэлектронный умножитель 16 преорразуетсветовые сигналы свечения клеток,пересекающих поле зрения микроско-,па, в электрические, которые затемусиливаются с помощью спектрометрического усилителя 17 и поступают навход многоканального амплитудногоанализатора 18, В результате амплитудного анализа получается гистограмма распределения измеряемого вклетках вещества. Таким образом, предлагаемое устройство может быть установлено на, предметном столике любого серийного Флуоресцентного микроскопа, превращая его при соответствующей комплектации промьиапенности электронными блоками в прибор для скоростного автоматического анализа свойств клеток. Кроме того, это устройст 50 во проще известного по кбнструкции и в изготовлении, так как насос,применяемый в известном устройстве для отвода жидкости с клетками,заменен полоской смачивающегося материала, благодаря чему сбор скопившейся на покровиом стекле жидкости с клетками осуществляетсясамотоком.оставехредРедактор Н,Лазаренккаэ 9289/33 Тираж ВНИИПИ Государстве по делам ивобрет 113035, Москвар Жлиал ППП "Патент тель НВоровЛ,ПилипенкокорректорВЮЮ73 Подписноеного комитета СССРний и открытийРаушская наб д. 4/5