Способ определения в кормах микотоксина патулина

(19) (1 И ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(56) 1. 5 йойй Я., Вц.егпеп 2. сго-.Ьо 1 ооса аььау оФ ра 1 ц 1 и ц 1 пдВас1 ца веоа 1 ег це. -",огпа о 1 азвосаТоп оГ о 1 Г 1 са апа 1 уйса 1 сЬеазь", 58,. 197-499, 975(54)(57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВКОРМАХ МИКОТОКСИНА ПАТУЛИНА,включаюший экстракцию образца корма т А 23 К ЦЦР Ц ЙЙР ПИ;д, С 126, 1/02 гексаном и этилаютатом, пропитку полученным экстрактом антибиотическик дисков и их наложение на засеянный тест микроорганизмом агар, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышении чувствительности способа, в качестве тесъ микроорганизма испап .зуют штамм ЕсЬЕчсЪа СО МФ2. Способпо и. 1, о т л и ч а ю ш и й с я . тем, чтб, с целью цифферев циации патулина и цругих антибиотических вешеств, цополнительно провоцят хроматографию экстракта и наложение хромато грамм на агар, засеянный укаэанным тест- микроорганизмом ЕсЬег 1 сМа сеЬ МФ.10363 30 1Йзобретение относится к метоцам миЪотоксикопогических исследований кормов дпя животных.Известен способ для определениябиологически активного патулина, за ключающийся в том, что купьтурЬй Ьс- сЕго ворОЕИоюЖЮ. 1368 инокулируется жидкая питательная среда ТДГ, состоящая из 0,5 г триптона, 0,25 г црожжевого экстракта и 0,1 г 10 глюкозы, растворенных в 100 мл дистиллированной воды. Инокулированная среда инкубируется в термостате в течение 15-20 ч, Конечная густота микробных клеток в среде проверяется с 5 помощью спектрофотометра. Коэффициент поглощения (Т) при использовании кювет 1 см и длине световой волны 520 нм должен равняться 70%, .В случае, если густота культуры не соответствует этим 20 показателям, ее разбавляют физиологическим раствором. 2% инокулята добавляют в среду ТДГ, содержащую 1% агара, и разливают ее в чашки Петри по 10 мл. Температура ТДГ-агара при 25 введении инокупята цопжна быть не бо лее 50 фС. На антябиологические диски размером 6,35 мм наносят растворенныйстандарт патулина в количествах3,5, 10 и 20 мкг, экстракт исследуемогообразца яблочного сока или зерна в количествах 3 5, 3.0 мкл, а также 20 мкл растворителя, применяемого цля раство ренин микотоксина патулина и экстрагирования исследуемых образцов.Диски раскладывают на чашки Петри, проводят предварительное преинкубирование в термостате при 5 С в течение 45 мин, а затем инкубируют в термостате при 37 С в течение 12-15 ч, Измеряют эо ны задержки. роста культуры разными количествами стандарта токсина и строят кривую зависимости размера зоны задержки роста культуры от количества внесенного микотоксина. По размеру зоны задержки зоны роста тест культуры исследуемым экстрактом корма определяют количество микотоксина патулина в пробе. Чувствительность данного способак патулину колеблется в прецелахот 1,7 до 2,2 мкг токсина, нанесенногона антибиотический диск.55Точность определения микотоксинапатулина данным способом сравнима сцругими хроматографическими и спектро графическими способами определения.Коэффициент корреляции при сравнении этих способов 0,996% 113 .Однако данньй способ не может быть использован как специфический для определения патулина при наличии другихприменяемый при определении штамм ЬасЖЬв аерАегюв МККЬ 1368, как и все другие микроорганизмы, чувствителен в равной степени и к другим анти биотикам и веществам, обладающим антибакте риальными свойствами.Цепь изобретения - повышение точности определения количества биологическис активного патулина в пробе корма, исключение биологического действия других антибиотических веществ, наличие которых возможно в экстракте, и достижение высокой чувствительности приопрецелении.Цепь достигается тем, что согласноспособу определения в нормах мякоток-:сина патулина,. включавшему экстракциюобразца корма гексаном и этилацетатом,пропитку полученным экстрактом антибиотическщс дисков и их наложение назаселенный тест-микроорганизмом агар,в качестве тест-микроорганизма используетск штамм ЕсЬечсИа со 61 М 4Кроме того, цля дифференциации натурлина от других антибиотических веществдополнительно провоцят хроматографиюэкстракта и наложение хроматограмм наагар, засеянный указанным тест-микроорганизмом ЕсЬег 1 сИа СОИ М 4Способ осуществляют следующимобразом,Пробу корма двукратно экстрагируют гексаном с послецуюшим трехкратным экстрагированием этилацетатом, Этилацетатный экстракт фильтруют через безводный сульфат натрия и упаривают цо получения 3.-5 мл и наносят его на стерильные антибиотические диски. Диски с определенным количеством нанесенного экстракта раскладывают на засеянный МПА. Для получения инокулированнобго агара его расплавляют, доводят до 50 С и вносят взвесь от оцносуточной культуры ЕсЬ 0"1 сЬ 1 а соО МФ (1 х 10 микробных тел в 1 мл взвеси) из расче та 1 мл иа 100 мл МПА. МПА с культурой разливают на горизонтально расположенные бактериологическйе чашки в количестве по 10 мл в 1, Диски на среду раскладывают равномерно от края чашки и других цисков.3Чашки с разложенными дисками вы-, аерживают 16-18 ч при 37 С. Затем учитывают характер роста Е.Соб М 4 и сравнивают зоны задержки роста культуры исследуемым экстрактом с зонами задержек роста чистым препаратом патулина. Патулин наносится на диски. в количестве 0,7, 1,5 и 10 мкг в вице 0,1% раствора в этилацетате.При обнаружении задержек роста куль" 1 О туры исследуемым экстрактом его нано сят в авукратном количестве (начиная с минимального количества, аающего зону угнетения роста культуры) на хромотографическую пластинку Силуфол ОУ -254 ф 15. и разгоняют в системе Б-У (бвнэолуксусная кислота 1:3), высушивают, раз рэзают вцоль хода экстракта пополамби обе половины пластин кладут силикагелвм вниз на поверхность инокулиро ванного МПА. Аналогично выдерживают при 37 С.В случае, если ваоль внутренней стороь ны хроматограммы обнаружена лишь одна зона задержки роста теса-культуры, ВЬ 25 которой равен стандарту патулина, расчет количества патулина в пробе производят по размеру зон зацержки роста исследуемым экстрактом, нанесенным на диски, по формуле30. задержки роста культуры;В объем экстракта пробы,Б - вес испытуемой пробы корма;Г наименьшее количество экстракта, которов поцавляет росттвсъффкультурьь40 35 Дл большей точности определения количества патулина в испытуемом образце можно строить график зависимости размера зон подавления роста культу 45 ры ЕсЬЕг 1 сЬ 1 о СоИ М 4 от количв ства нанесвнного на диск чистого препа- рата патулина, с помощью которого опредвляют количество патулина- в экстракте, нанесенном на антибиотичес кий циск.аЕсли при биоавтографичвском проявлении хроматограмм; исследуемого экстракта вдоль внутренней стороны обнаруживается аве или более зоны эацврвки роста культуры, количество патулина определяют по той же формуле, но при 6315этом учитывают количество экстракта,нанесенное на хроматограммуАхВГ ф (2)БхГ где А - наименьшее количество патулина,нанесенное на хроматограмму,которое вызывает образование зоны задержки роста культуры биоавтографическом проявлении хроматограммы;В - объем экстракта пробы;Б - вес испытуемой пробы корма; Г наименьшее количество экстракта, нанесенное на хроматограм му, которое вызывает образование зон задержки культуры при бноавтографическом проявлении хр омат ограммы.Аналогично оличвство патулина мож но определять цо графику зависимости зон подавления роста культуры ЕсЪе " - сМс Соб Идиот количества нанесенного . на хроматограмму станцарта патулина,П р и м е р . 50 г сухого измельченного корма экстрагируют цвукратно; 1 раз в 100 мл гексана в течение 1 ч, вторично в течение 10 мин 50 мл гексана, Затем пробу высушивают и экстрагиру ют 200 мл этилацвтата в течение 1 ч с повторным двукратным экстрагированивм по 15 мин с 100 мл этилацетата, Этилацетатные экстракты сливают в одну колбу и выпаривают (лучше под ваку умом прнтемпературе до 45 С) до обье ма 2 мл и наносят в количестве от 1 до 40 мкл на антибиотические диски, В качестве контроля на диски наносят 0,7, 1, 5 и 10.мкгпагулина в вице 0,1%раствора в этилацетате,. Диски равномвр но раскладывают на бактериальные чашки с засеянным:. МПА (10 мл МПА на 1 чашку содержащего 0,2 мл взвеси су точной культуры ЕСЬЕгсИ 1 о СОИ МФ, 1 х 10 микробных тел в 1 мл взвеси, .Чашки с дисками выдерживают в твчв ние 1618 ч в термостате при 37 С, после чего учитывают характер роста культуры. При учете размеров зонза двржки роста, например, обнаружено по давление роста культуры дисками, со держащими 20 мкл экстракта и выше. Исходя иэ этого, на хроматографическув пластинку нанооят экстракт в количв стве от 40 цо 80 мкл и стандарт пату лина от 1,4 цо 10 мкл. Плаетину высуни шивают и разгоняют в системе Б-У, После раэгонки пластинки снова выл .5 10363 шивают, разрезают по оси, расклааывают силикагелвм вниз на аналогично инокулированный МПА и выдерживают в том же температурном режиме,В случае обнаружения на пластинах лишь одной зоны задержки роста ульту. ры с КЬ, равным патулину, делают рас чет патулина в образце корма по раэме рам зон задержки роста культуры исслв дуемым экстрактом на диске путем по О строения калибровочного графика или же по формуле (1);ХО ( мкг х 2000 мкл 1450 г х 20 мкл15В случае, если обнаружено аве зонызадержки роста вдоль внутренней стороныразрезанной хроматограммы, провоаятрасчет количества патулина в пробе,применяя аля этого размеры эон угнетения роста культуры экстрактом, нанесенным на хроматографичвские пластинки,путем построения графика или по формуле (2)1,4 мкг х 2000 мкл50 609,33 мкг/г.50 г х 60 мкл 15 ЬСпособ определения патулина прост в исполнении и экономичен, позволяет определять биологически активный патулин в количествах 0,7 мкг в грамме корма и выше, Чувствительность способа может быть повышена путем увеличении навески исследуемого образца для экстрагирования, а также увеличением количества экстракта, наносимого на антибиотичео кий диск. Теоретически преаельная чувствительность способа 0,7 мкг на навеску исследуемого образца, что исходит из чувствительности ЕСЬЕгсЬ 1 о со 4 ИА ., к 0,7 мкг/диск и выше.Для исполнения способа опреаеления патулина в кормах для животных не требуется дорогостоящих и дефицит ных реактивов и питательных сред, исхоая из чего .он вполне выполним в любой мико- или химикотоксикологической лабораториях.Применение изобретения в практике ветеринарных лабораторий позволяет своевременно профилактировать патулинотоксикоэы сельскохозяйственных жи воъных, .а также их диагностику на начальной стадии отравления животных.МСоставитель С. СютлышевРедактор О. Черниченко Техред А. БабинвцКорректор А, ПовхЗаказ 5875/3 Тираж 567 Поаписиое ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 13035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП Патент, г, Ужгород, ул. Проектная, 4