Иммунодиагностикум

(51)М. Кл. А 61 К 39/00 3 Ьаударстинаыа коветет веер ае делан кэааретекик и открыткаИУНОДИАГНОСТИКУИ при роз гии леаллергиеи 1 ,СССР пецифи- иммунитоза,акарологии в разработаны сустановления против отодекоедроза, в тония довольно плотоядных, ъя зверей в о колеблется в В современноии за рубежом неческие тесты длятета у животныхсаркоптоза и ноткак эти заболевараспространены уженность поголовзверохозяйствахлах 10-254,Цель изоние антигена время, широко и поратдельны предебретения для имм приготовлеиагностики Изобретение относится к акароло и может быть использовано для выяв ния иммунитета к отодектозу ( ушной чесотке), саркоптозу и нотоедрозу ( зудневой чесотке плотоядных.Известен клещевой антиген для диагностики и лечения аллергической астмы человека, а также диагностицес кого тестирования и клинической десенсибилизации пациентов с клещевой отодектозе, саркаптозе и нотоеде плотоядных.Поставленная цель достигается применением антигена из клещей родов Ойойесе, Батсор 1 ез, Ио 1 оейтез в качестве иммунодиагностикума при зудневой и ушной чесотке плотоядных.Антиген готовят следующим образом.Собранных паразитов от больных животных заливают эфиром, после чего опроцеживают через сито, размер отверстий у которого 0,8 мм. Такой размер яцеи сита позволяет свободно проходить клещам вместе с жирорастворителемэфиром), Все крупные частицы 5волос, корочки, струпья и т.д,) ос-, таются на поверхности сита. Такая операция позволяет очистить клещей от посторонних примесей. Клещей отделяют от обезжириваюмего растворителя с помощью воронки Бунхнета со слабым всасывающим действием, Клещей промывают 3-ч раза в небольшом количестве обезжиривающего растворителя, а затем3 90овысушивают при 18-22 С, Высушенных клещей помещают в ступку с битым стеклом, тщательно растирают и доводят до лорошкообразной массы. Затем порошок, полученный из паразитов, экстрагируют с помощью физраствора в объеме 1:50, Полученная суспензия тщательно перемешивается, фильтруется через бумажные фильтры или марлю с ватой, и полученный фильтрат центрифу гируется при 3000 об/мин в течение 30 мин, Верхний слой сливают и к нему добавляют раствор Формалина (из расчета на 100 мл антигена 0,1 мл формалина).Антиген представляет собой коричневую прозрачную жидкость, свободную от взвешенных частиц, Серологически активен в реакциях диффузной преципитации в агаровом геле (РДПА) и встреч ного злектроиммунофореза (ЭИФ),Реакция РДПА представляет собой агрегацию (соединение) клещевого антигена с сыврроткой крови в присутствии специфических антител и проявляется в образовании полосы преципитата в слое агара между лунками, содержащими антиген и имунную сыворотку,Для постановки РДПА используют испытуемые сыворотки, не требующие специальной обработки. В отдельных случаях для постановки реакции могут быть взяты пробы цитратной крови, По своей простоте метод преципитации в агаре доступен для большинства лабораторий. Для постановки РДПА применяют, осветленный бактериальный агар в виде 1 г-ого геля на стериальном физиологическом растворе. Раствор агара готовят и расплавляют на водяной бане.Растопленный агар заливают ровным слоем на предметные стекла или в чашки Петри толщиной 3-4 мм, После застывания агара в нем вырезают круглые лунки диаметром 3 мм и глубиной 3-4 мм так чтобы объем каждой лунки1зсоставлял 0,02-0,03 см , Расстояние между соседними лунками должно быть 3-4 мм. Вырезанный агар удаляют с помощью иглы от шприца или отсасывают с помощью пастеровской пипетки,Лунки целесообразно делать специальным штампом, Необходимо следить за тем, чтобы лунки не сообщались между собой, а в агаровом слое не было трещин, Порядок расположения лунок следующий; вокруг центральной 6567 4лунки, содержащей антиген, располагают на равном расстоянии (3-4 мм)шесть лунок для сыворотки,После заполнения стекла или чаш 5 ки Петри с агаром помешают в термостат при + 37 С во влажной камере (вочашке Петри, эксикаторе).Предварительное чтение реакциипроизводят через 4-6 ч, а окончательО ное - через 18-20 ч.При чтении реакции преципитациив агаре стекло рассматривают на темном фоне, в проходящем свете, направленном под углом 45 к объекту. Исо15 точником света может служить осветитель микроскопа. Реакция оцениваетсяпо степени четкости линии преципитата,Положительная РДПА характеризуетсяналичием тонкой, четкой линии преци 20 питации между лунками с сывороткой иантигеном. Расплывчатые полосы в геле,диффузные или органические измененияего прозрачности, а также отсутствиеих расценивается,как отрицательный25 результат РДПА.Положительный результат РДПА указывает на наличие антител в крови уживотных к зудневой или ушной чесотке, т. е, на наличие иммунитета кзО этим заболеваниям,Отрицательность РДПА свидетельствует об отсутствии иммунитета,Для выявления животных, невосприимчивых к зудневой или ушной чесотке,35можно также применять реакцию встречного электроиммунофореза, Этот методболее экспрессивен.Для постановки реакции встречногоэлектроиммунофореза на чистоту обез 4 Ожирекную стеклянную пластинку размером 8 х 15 см наливают 30 мл 13-ногогорячего раствора Дифко" или аналогичного осветленного бактоагара, приготовленного на буферном растворе,45разведенном пополам дистиллированнойводой. После застывания в агаровомгеле делают лунки при помощи пробойника, соединенного трубкой с вакуумнасосом.15 О Диаметр лунок должен быть 1,8 мм,зглубина 2,5 мм, объем 0,02 см , рас -стояние между центрами соседних лунок каждого горизонтального ряда должно составлять 6 мм. Лунки следует55 располагать не ближе 1 см от краяагаровой пластинки,Для более точного соблюдения дистанции между лунками используют заФормула изобретения Составитель А, ФилипповаРедактор О. Юрковецкая Техред 3. ФантаКорректор Л. Бокшан Тираж 717 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Заказ 448/9 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,5 9065ранее размеченную миллиметровую бумагу, которую кладут под стекляннуюпластинку, или же используют направУляющую пластинку из оргстекла с просверленными для пробойника отверстиями.Буферн.е растворы, применяющиесядля постановки РИЭОФ, должны иметьрН 8,6-8,9. Вороналовый буФер готовятпутем растворения 10,32 г мединала 1 ов 300 мл дистиллированной воды с последующим добавлением 1,84 г веронала.Раствор помешивают и держат в водянойобане при 40 С до полного растворенияверонала, 15Кровь у животных берут до кормления в стеклянные капилляры, которыес одного конца закрывают пластилиноми центрифугируют при 1500-3000 об/минв течение 5 мин. гоКаждую испытуемую сыворотку вносят в отдельную лунку четных вертикальных рядов, причем в последниелунки рядов вносят соответственноконтрольные положительную и нормальную сыворотки. Антиген закапываютпастеровской пипеткой во все лункинечетных рядов, после чего пластинкупомещают в камеру прибора для бумажного электрофореза марки ЭФили зоаналогичного прибора так, чтобы токпроходил параллельно горизонтальнымрядам лунок,К краям пластинки прикрепляют полоски Фильтровальной бумаги и опускают их свободные концы в ванны, заполненные буферным раствором, Камерузакрывают крышкой и подключают к выпрямителю тока так, чтобы положительный полюс был справа (со стороны 4 окрайнего вертикального ряда с сыворотками). Сила тока должна составлять10-15 мА на каждую стеклянную пластинку,Результаты реакции анализируют через 30-60 мин после размещения пластинки в силовом поле. Для этого пластинку осматривают в косопроходящем 67 6светеосветитель ОИили другиеисточники света) на емном фоне.Положительная реакция встречногоэлектроиммунофореза характеризуетсяналичием тонкой, четкой линии преципитации в горизонтальных рядах геляна середине расстояния между лункамис сывороткой и антигеном. Расплывчатые полосы в геле, диффузные илиограниченные изменения его проэрач"ности, а также отсутствие измененийрасцениваются как отрицательный результат.Положительный результат реакциивстречного злектроиммунофореза указывает на наличие специфических антител у животных к ушной или зудневойчесотке.Использование изобретения позволит выявить иммунных животных к,зудневой и ушной чесотке, а при Формировании стада - отбирать поголовьезверей, невосприимчивых к отодектоэу,саркоптозу и нотоедроэу. Это даствозможность увеличить деловой выходмолодняка, снизить затраты на ветеринарно-санитарные мероприятия по борьбе с указанными заболеваниями, предотвратить ущерб от падежа.Предлагаемые методы выявления иммунитета с помощью РДПА и встречногоэлектроиммунофореза позволяют создатьпоголовье зверей, невосприимчивыхк отодектозу, саркоптозу. и нотоедро-зу,Применение антигена, приготовленного из кпещей родов ОСос 1 ес 1 ег, БагсорГеэ, Иойосйгеэ, в качестве иммунодиагностикума при зудневой и ушнойчесотке плотоядных,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Патент франции 11 2 145376,.кл. А 61 К 23/00, 1973.