Способ изготовления препаратов зародышевых мешков растений

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик(22) Заяелеио 091177 (21) 2543332/30 5)М. Кл.А 0167/О 0 01 М 1/2 явки Но исоедннение оиитет твенный СССРаи изобре открытий осу 3) Приорите нийОпубликоеанОО 10,79, Бюллетень Йо Дата опубликования описания ОЫ 07 вторыобретени(5 ПОСОВ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАР АРОДЬЫЕВЫХ МЕШКОВ РАСТЕНИ 2 специалмешало ся к областики и может бытьтовлении нагл, техникумовьском хоэяйстгенетико-селекных учрежденияхдля ускорения ежноеждеов их ется суспензиязародышевых чению зародыше Известен способ выделения зародышевых мешков растений путем мацерации тканей, Его сущность сводится кмацерации фиксированных семяпочекферментами желудочной железы улитки,нарушению целостности окружающих тканей путем использования специальныхмешалок и центрифуг, последующемуокрашиванию взвеси в пробирках ацетормином и изготовлению временныхепаратов 1,астно еннымях икроов),следе ка пр ения препараешков имеет Эт тов ц ряд н пр т.е. ному дель)от способ иэготелых зародышевыедостатков:епараты являютспригодными лишьиспользованию (У Фикивают ации шают с- мавременными,й кратковрем течение 2-3 и о Изобретение относит микроскопической техни использовано при приго лядных пособий для шко и вузов, а также в сел ведля интенсификации ционных работ и в науч ботанического профиля научных исследований. требуется применениеаппаратуры - центрифуг,электромоторов и т.п.;в процессе центрифугированичасть зародышевых мешков неизбподвергается механическим поврниям и только несколько десяткостаются целыми;на препарате получасоматических клеток имешков, что мешает изувых мешков;препараты не являются контрокрашенными.Наиболее широко распространв эмбриологических исследованиявляется способ приготовлениятомных (разрезанных на ряд срепостоянных препаратов (2),Данный способ заключается вющем. Исследуемый материал (чащвсего завязи или семяпочки) фируют, например ГАА (формачин,уксусная кислота), пРомывают осатора 70-ным спиртом, обеэвоспиртами повышающейся концентрот 70 до 100, далее спирт эамхлороформом или ксилолом дляледующей пропитки исследуемогтериала парафином, которую проводятв термостате в течение 7-10 суток,Пропитанный парафином материал охлаждают, монтируют в парафиновыеблоки и режут на микротоме на рядтонких срезов, которые монтируют 5на предметных стеклах и сушат в термостате в течение 1-3 суток. Высушенные срезы, смонтированные на предметном стекле, окрашивают, для чего,.предварительно с них удаляют парафинксилолом, ксилол спиртом и срезы про"мывают водой. Окрашенные препаратыобезвоживают 100-ным спиртом, обрабатывают ксилолом, заключают в канадский бальзам и закрывают покровнымстеклом.К недостаткам укаэанного способаотносятся чрезвычайная длительностьи трудоемкость при максимальнойскорости работы горновый препарат можно получить лишь через 16-18 суток),невозможность получения целых зародьпаевых мешков растений, так как прирезке исследуемого материала на микротоме зародышевый мешок оказываетсяразрезанным на несколько частей, чтозатрудняет его исследование под микроскопом.Целью изобретения является ускорение и упрощение изготовления препаратов целых зародышевых мешков рас- ЗОтений (контрастно окрашенных в массовом количестве).Указанная цель достигается тем,что окрашивание исходного материалаосуществляют непосредственно после 35фиксации и промывки, а после мацерации препарирование семяпочек проводятпутем надрыва их кутикулы и извлечения зародышевых мешков, последниепереносят капилляром на фильтровальную бумагу, помещая ее на предметное стекло, а обезвоживание этанолом иобработку их ксилолом производят путем прокапывания,Для эакрепленйя зародышевых мешков на месте во время обезвоживанияих кладут на отрезок фильтровальнойбумаги, расположенной горизонтальнона предМетном стекле.Для сохранения целостности пропитанных ксилолом зародышевых мешковпри переносе на чистое предметноестекло зародыш вые мешки собираютприкосновением к ним капли густоготянущегося) канадского бальзама, расположенной на конце тупой55препаровальной иглы, и последующимпогружением этой капли с объектомв ксилол, нанесенный на предметноестекло. Для отделения зародышевых мешков иэ суспензии соматических клеток в цитазу помещают каплю воды и переводят зародышевые мешки из цитазы в воду при помощи препаровальной игль,65 Указанные отличия позволяют исключить применение специальной аппаратуры - микротомов, термостатов, центрифуг и т.п., ряд операций и часть реактивов (например, замену спирта хлороформом или ксилолом, пропитку материала парафином, резку на микро- томе) и, следовательно, ускорить процесс (не 16, а 4 суток), упростить его, снизить трудоемкость изготовления препаратов, избежать нарушения целостности зародышевых мешков растений и освободить их от соматических клеток.Кроме того, эти отличия позволяют обезвоживание и окраску проводить в пробирках, а не на предметных стеклах, что уменьшает расход реактивов и позволяет одновременно обработать большое количество зародышевых мешков, которые могут монтироваться на одном предметном стекле.Проведение окраски по Фельгену непосредственно после фиксации и промывки исходного материала дает возможность окрасить зародьпаевые мешки внутри целых неразрушенных органов растений, что предотвращает возможность порчи и потери исследуемого объекта при его микроскопических размерах.Использование фильтровальной бумаги при обезвоживании и мацерации позволяет закрепить микроскопические зародьппевые мешки на предметных стеклах без помощи специального клеящеговещества.П р и м е р. Материал фиксируют фиксатором ГАА, промывают и хранятв 70-ном спирте, Фиксированные колоски или цветки в пробирках промывают 4-5 ч дистиллированной водой при комнатной температуре. Затем проводят холодный гидролиз. В первой пробирке в 1 н. соляной кислоте материал выдерживают 1 ч и в 5 н. соляной кислоте - 1,5 ч, во второй в 1 н, соляной кислоте выдерживают 1 ч. После гидролиза материал помещают в реактив Шиффа и выдерживают 16-17 ч в холодильнике прио2-4 С, промывают водопроводной водой 3-4 ч, подкрашивают гематоксилином Эрлиха Или другими красителями (время подкраски устанавливают опытным путем в зависимости от концентрации красителя), промывают дистиллированной водой 1-2 ч, вццеляют завязи (т,е. часть цветка, внутри которой располагается семяпочка с зародышевым мешком и соматическими клетками), помещают в концентрированный фермент .цитаэу на предметное стекло с углублением и оставляют на 24 ч во влажной камеречашки Петри при комнатной температуре.Мацерированный материал переносятна предметное стекло. Препарируют .под689643 Формула изобретения Составитель М, ДранишниковРедактор Т. Иарганова Техред М, Келемеш Корректор Ю.МакаренкоЗаказ 5808/1 Тираж 755 ПодписноеЦИНИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113835 Москва, Жд Раушская набе д 45Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная,4 бинокулярной лупой. Наружную оболочкусемяпочки осторожно надрывают тонкоотточенными препаровальными игламии зародышевый мешок вычленяют изсемяпочки вместе с частью соматических клеток, Затем в суспензию клетокв цитазе вводят 1-2 капли дистиллированной воды, Соматические клетки,удерживаемые остатками цитазы, остаются на стекле. Зародышевый мешокс помощью иглы в капле воды переводят ово взвешенное состояние, затем переносят капилляром (диаметр 0,2 мм)на отрезок фильтровальной бумаги2 х 2 см, лежащий на предметном стеклеи предварительно увлажненный дистиллированной водой, Зародышевый мешококазывается на бумаге почти без суспензии соматических клеток. Перенеся на бумагу несколько зародышевых мешков, их обезвоживают непосредственно на предметном стекле, расположенном горизонтально. Сначала с одного края бумаги наносят несколькокапель 40-ного спирта, а с противоположной стороны подводят сухую фильтровальную бумагу, которая всасывает 25избыток жидкости. В этом спирте выдерживают 10 мин. Таким же образомпроводят операции с 50, 70, 96 и 100-ным спиртом, выдерживая объект по10 мин в каждом из спиртов.Все работы 30по обезвоживанию на предметном стеклепроводят в чашках Петри, Предметноестекло с материалом, заключенным вксилол, переносят под бинокуляр и тупой иглой, предварительно смоченнойгустым канадским бальзамом, осторожными прикосновениями к зародышевыммешкам собирают их на кончик иглы,переносят в каплю ксилола на чистоепредметное стекло и покрывают покров- о ным. Полученные препараты сушат в термостате при 42 С.Предлагаемым способом изготавливают постоянные препараты, которые могут храниться длительное время, что позволяет вернуться к их изучению и создать документированность эмбрио" логического исследования. Способ изготовления препаратовзародышевых мешков растений, включаю"ший фиксацию исходного материала,промывку, обработку его ферментомцитаза при мацерации завязей илисемяпочек, препарирование, окрашива"ние, обезвоживание.этанолом, обработку ксилолом, заключение в канадскийбальзам, помещение объекта на предметное стекло для последующего микро.скопирования, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью ускорения иупрощения изготовления препаратовцелых зародышевых мешков, окрашива"ние исходного материала проводятнепосредственно после фиксации и промывки, а после мацерации препарирование семяпочек проводят путем надрыва их кутикулы и извлечения зародышевых мешков, последние переносяткапилляром на фильтровальную бумагу,помещая ее на предметное стекло, аобезвоживание этанолом и обработку ихксилолом проводят путем прокапывания.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Еналаева Н.Х. и др, Цитологияи генетика, т,6, вы,п 5, 1972,2. Дженсен У. Ботаническая гистохимия, Мир, 1965, с. 59-77 (прототнп).