Способ обнаружения дикаина

Ъ1аО П И С А Н И Еии 682798ИЗО БР ЕТЕ Н И Я,К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 28.03,77 (21) 2407070/23511; , Тг.л 2 С 01 Я 21,06 исоединением за ки -Государственный комитет(45) Дата опубликования огшсания 18.10.79 но делам изобретений 5 З) ".Л 1 543.615,7(72) Авторы изобретени Д, В, Песахович и Б. Н, Бекетов Тюменский государственный медицинский институ(71) Заявитель 4) СПОРО АРУЖЕНИЯ ДИКАИНА Изобретение относится к аналитической химии, а именно, к способам обнаружения дикаина, оно может быть использовано в химико-токсилогическом анализе и биофармацевтических исследованиях. 5Известен способ обнаружения дикаина путем обработки анализируемой пробы концентрированной азотной кислотой с последующими удалением влаги и добавлением к сухому остатку спиртового раствора 1 О едкого кали с получением при этом кроваво-красного окрашивания 1. Однако этот способ имеет малую точность.Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому ре- Й аул ьтату является способ обнаружения дик анна, заключающийся в обработке анализируемой пробы раствором серной кислоты, центрифугировании и отделении примесей, подщелачивании полученного 20 при этом раствора и обработке его хлороформом, очистке хлороформенного экстракта хромотографией в тонком слое сорбента с последующим микрокристаллоскопированием 21.25Данный способ продолжителен и имеет низкую чувствительность, поскольку не всегда можно обнаружить дикаин (редко имеется нераспавшаяся молекула его). Это обусловлено тем, что в животном организме дикаин под влиянием ферментов крови уже через короткое время после его введения распадается с образованием основных метаболитов - продуктов его гидролиза и-бутиламинобензойной кислоты и диметиламиноэтанола.Целью изобретения является повышение чувствительности и сокращение времени определения.Предлагаемый способ обнаружения дикаина заключается в обработке гомогенизируемой анализируемой пробы раствором соляной кислоты, нагревании, центрифугированип и отделении от примесей, в подкислении полученного после отделения примесей водного раствора до рН 4,0 - 4,5 с обработкой его хлороформом, очистке хлороформенного экстракта электрофорезом с последующей обработкой электрофореграммы последовательно соляной кислотой, парами брома, нитритом натрия и хинозолом в присутствии гидроксида натрия.Отличительными признаками способа являются гомогенизация подкисленной анализируемой пробы, нагревание, подкисление полученного после отделения примесей водного раствора до рН 4,0 - 4,5, очистка хлороформенного экстракта электрофорезом, последующей обработкой электрофореграммы последовательно соляной кислотой, па682798 35 40 45 50 Способ обнаружения дикаина путем обработки анализируемой пробы раствором минеральной кислоты, центрифугированием и отделением примесей, обработкой полученного при этом водного раствора хлороформом, очисткой хлороформенного экстракта, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и сокрашения времени определения, после обработки кислотой с одновременной гомогенизацией анализируемую пробу нагревают, полученный водный раствор после отделения примесей подкисляют до рН 4,0 - 4,5 и о:пстку хлороформепного экстракта осуществляют электрофорезом с последующей обработкой электрофореграммы последовательно соляной кислотой, парами брома, питритом натрия и хинозолом в присутствии гидроксида натрия. 55 60 65 рами брома, нитритом натрия и хинозолом в присутствии гидроксида натрия. Наличие дикаина в биологическом материале определяют не по молекуле дикаина, а по его метаболиту - а-бутиламинобензойной кислоте, являющейся более устойчивым соединением и сохраняющейся более длительное время. Кроме того, с целью экономии времени на химико-токсикологический анализ обработку анализируемой пробы проводят при одновременной гомогенизации биологического материала в микроразмельчитсле тканей РТводой, подкисленной соляной кислотой, Очищают вытяжку от соэкстрактивных веществ нагреванием на кипящей водяной бане с последующими центрифугированием и экстракцией хлороформом при рН 11. Предварительно очищенную вытяжку подкисляют до рН 4,0 - 4,5,и экстрагируют хлороформом и-бутиламинобензойную кислоту, Хлороформное извлечение очищают электрофорезом на бумаге. Электрофореграммы высушивают при комнатной температуре и проявляют реакцией азосочетания. Для этого от электрофореграммы (26 х 2 см) отрезают продольную полосу шириной 0,5 см, которую опрыскивают 1 н, раствором соляной кислоты и подвергают воздействию паров брома в течение 5 мин. Затем последовательно опрыскивают 3%- ным раствором нитрита натрия и через 3 мин 0,3%-ным раствором хинозола в 8/оном растворе гидроксида натрия. П р и м е р. 10 г печени трупа, содержащей 1000 мкг дикаина, после 24 ч инкубирования гомогенизируют в присутствии 25 мл разбавленной соляной кислоты с последующим центрифугированием при 6000 об/мин. Операцию повторяют 3 раза. Центрифугаты объединяют, подщелачивают 25 О/о-ным раствором аммиака до рН 11 и экстрагируют хлороформом дикаин 4 раза. При однократной экстракции хлороформом при рН 11 экстрагируется 93/о дикаина. Основной метаболит дикаина и-бутиламинобензойная кислота (и-БАБК) при рН 11 практически не экстрагируется. При экстракции дикаина в хлороформный слой переходит основная масса соэкстрактов. Определение и-БАБК. Вытяжку после экстракции дикаина подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 1 и нагревают в течение 1 ч при 100 С с целью гидролиза связанной и-БАБК и отделяют центр ифугированием коагулирующие при нагревании биокомпоненты. Центрифугат подщелачивают 25%-ным раствором аммиака до рН 4,0 - 4,5 и экстрагируют хлороформомм и-БАБК 4 р а за. При однокр атной экстракции хлороформом при рН 4,0 - 4,5 кстрагируется 97/, и-БАБК. Хлороформпые экстракты (рН 4,0 - 4,5) объединяют и 5 10 15 20 25 30 растворитель испаряют. Сухой остаток растворяют в 96 О/,-ном этаноле. Обнаружение и-БАБК проводят по следующей методике, На полоску фгильтровальной бумаги наносят в несколько приемов аликвоту полученного раствора экстракта, Место внесения обрабатывают 1 н. раствором соляной кислоты и затем парами брома до образования устойчивой желтой окраски на месте нанесения раствора экстракта. Далее последовательно обрабатывают 3%-ным раствором нитрита натрия и через 3 1 гиц 0,3%-ным раствором хинозола в 8/о-ном растворе гидрооксида натрия. Образуется кирпично-красное окрашивание, интенсивность которого зависит от количества о-БАБК в пробе, Интенсивность окраски сохраняется более двух лет. Чувствительность окраски (реакции) 0,5 мкг и-БАБК в пробе,Очистку раствора экстракта (рН 4,0 - 4,5) проводят электрофорезом на бумаге по следующей методике.Аликвоту раствора экстракта наносят в виде сплошной полосы на электрофореграммы (2 х 26 см, хроматографическая бумага ФН 15),и проводят электрофорез в течение 1 ч при напряжении 400 В. Начальная температура электролита 20 С. Одновременно проводят электрофорез свидетеля - г-БАБК,На проведение анализа биологического материала предлагаемым способом необходимо 10 - 12 ч на полный анализ. Использование гомогенизации сокращает время изолирования и повышает выход,изолируемых веществ вследствие резкого увеличения поверхности контакта клеток ткани с извлекателем.Чувствительность определения данным способом выше, чем известным, в 25 раз. Формула изобретения682798 Составитель Л. СоломенцеваТекред Н Строганова Редактор О. Кузнецова Корректор С. Файн Заказ 765/968 Изд,485 Тираж 1090 ПодписноеНПО Поиск Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Тип. Харьк. фил. пред. Патент Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:1, Государственная фармакопея СССР, изд. Х, М 1968, с, 244. 2, Роговский Д. Ю. Исследование дикаина и ксикаина в судебно-химическом анализе. Автореферат кандидатской диссертации,792, Львов, 1968,