Способ культивирования микроорганизмов

ОП И САН ИЕ 1),ИЗОБРЕТЕН Ия Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ олнительное к авт. свид-ву, Бюллетень асударственнв 1 н комитетСовета Министров СССРпо делам изобретенийи открытий) Авторы изобретения ИностранцыЛпещ Пркоп, МироспавЗденек Фенцп, Мирослави Франтишек Штрос(71) Заявител ятие кы прммысл працовани ропы(43) Опубликовано 25,04,7 (45) Дата опубликования о 1Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается кулитивирования микроорганизмов в питательной среде.Известен способ культивирования микроорганизмов в питательной среде, содержащий кислый фосфат калия, аммониевую соль сильной минеральной кислоты и источник углерода, при поддержании рН путем добавления источника углерода и основания 11.Однако такой способ не обеспечивает эффективного культивирования микроорганизмов.Целью изобретения является повышение эффективности культивирования.Это достигается тем, что рН питательной среды поддерживают в пределах 2,0 - 6,0 введением неорганического основания и источника углерода, который вводят в количестве 75 - 85% 15 от теоретически требуемого, 1)ри этом остальное количество вводят в течение 5 в 1 сек с момента повышения концентрации кислорода на 10 - 80% от концентрации насыщения.Кроме того, в качестве неорганического основания используют аммиак, а в качестве источника углерода - этанол или н-алканы.Питательная среда включает в свой состав минеральные соединения, содержашие необходимые элементы, в том числе рассеянные элементы и источники углерода такие, как углеСоботка, Мироспав Швойгр Рут, Ян Квасничка водороды, особенно н-алканы, метанол, этанол, уксусная кислота, сахароза, глюкоза или сульфптнь)с растворы.Если источник углерода неде или если это )еобходпмо, тотделы)ого доз,)тора, а нс совванием.Теоретическое количество источника углерода составляет то количество, которое можно рассчитать по среднему содержанию азота в образующейся биомассе и коэффициенту выхода.Постоянной насыщения является концентрация углерода, приводящая к снижению скорости роста на половину максимальной величины. Концентрация кислорода в установившемся состоянии в культивируемой среде составляет определенную концентрацию кислорода, растворенного в кхльтивирмемой среде, которая имеется в том случае, когда существует оптимальная концентрация источника углерода. Концентрация насыщения кислорода в куль тивируемой среде составляет максимально возможное количество кислорода, которое может оыть растворено в культивируемой среде при темперагуре и давлении культивирования независимо от того, являются ли другие условия культивирования оптимальными. Количествоз 603662 источник углерода, вводимого отдельно для регулирования углеродного балансы, должно бь)ть,1)ст 1 Очным, чтобы вызвап снижение концентрации растворенного кислорода ло концен 1;)ацип в установившемся состоянии за время от 30 ло 120 сек (предпочтительно за 30 сск)Микроорг)низмы, которые могут быть использованы, включают в свой состав бактерии, дрожжи и плесени, например Сдпсс)а ц 111 з и Сапаса 11 рох 11 са.Пример У. Культивирование дрожжей Сапс 11 с 1 а с 111 в проволят в бродильном чане оощим объемом 30 л и рабочим объемом 15 л в среде, в которой в качестве источника углерода используют спнтетичсский этанол. Бродильный, чан снабжен механической мешалкой и скорость растворения кислорода достигает 280 молей кислорода в 1 час на 1 л. Сырой использованный этанол содержит 90 об.0/О (85,7 вес.)/О) э) гсп,)лд.1 Итательная среда для выращивания 10 г,л ., ХХ 1)О.+ КЕИ СОЛСРсъи 11 ЕРВОНЫЫ.1 Ь 5 С) НЫв г1.,11., ):.80, 4К 1"РО 0,8Мд)О; 711,0 0,25;ИБО. 7 Н,О 0,01К 15 л основной среды в бродильном чане 25 с рН 4,5 лобдвляют закваску, соответствуюцую ныч;)льИой копцентрыции сухих дрожжси 2 г/л и 15 мл этднолы. После этого начинается процесс куль гивпровднпя, протека)ощий при 30 С.рН срслы регулируют так, цтобы его величина состывлялы 4.0. Дляэтс)го используют олноЗО позицпоный регулятор с заланным значением 4 О. Если р 11 культивируемой среды падает ниже 4,0, то сигнал, 1 н)ступы 101 ций из рН-метра включст л 1)затор, при помс)щи которого вводят и смесь аммиака и этдполы. Отношение З," 1 м)1 иыкс 1 1 с 1111 тстичсско.х .)1 аОлм, которс НСООХО, И)Н ВЗ 51 ТЬ, РДСС 1 ИТЫ 15 ПО , ИСХОД 1 ИЗ содсржып 5 сухих 1 роккей (10 г)г 1, т. е.1 00 1) 1 рслпола гас мого сОлср ж 11 н и Я азоты (10 ) 1 вес схо 1 Оиомд 1 ссы) и коэффи Сита в 1 холы (0,68). На основании этого рас 1 сгы пс)л,чаю сссь ал 1)1 иака и 80% От рдсчс тОго 1,0 гчести этанола.Нсл)01 д) ок источника уг,ср)да в кульгивирусмой среде зафиксирован в течение 510 сск ны ос 1 Овс оыстрого повышеш)я концентрации кпс,оролы, которая увеличивается от О до 30% от концентрации насыщения, определенной при помо 1 ци дпализыгора для растворенного кислорода полярографического типа.Фс.тоэлектричсский регулятор, соединенный с кислородным ыасизсТором, подает сигнал, ) который опсрывдет дозатор. Из дозатора вводят дон)лнитсльный этапол. Госле добавления этынолы концентрация растворенного в куль.пвацноиной среде кислорода падает примерно н тсчсннс 10 сек до 10 / от концентрации0 55 насыщсИ 1 я. Затем вновь проводят дозирование этанольной смеси. Приблизительно 20% от об)пего количества оглощенного этанола вводят лопол аггел ьн ь,способом. Общее количество поглощенного процссс культивирования этанола составл "т 220 г абсопотного 60 этанола. Процссс культивирования заканчивыстся через 6 чдс. Из 1 г абсолютного этанола получают 0,64 г сухого вещества дрожжей с содержанием 0,408 г сырого белка. Сухое вещество оиомассы солержит 9,8% нуклсиновых кислот.При.ер 2. Культивироныпис .ц ожкей Сыпс 1 с 1 ы 1 ро)у 11 са в присутсзнии отлсльньх парафинов в качестве источникд углерода проводят в том кс бродильном чане и с использованием тех же осл)овных материалов, что и культивирование, описанное в примере 1. Использованные парафины содержат 99,5 вес.)/О н-алкгнов, 00.1 ьнИнство углсводоэол в имест4 - 17 у 1,1 с- родных атомов и их плотность составляет 0,97 1;см, К 15 л основной среды лобавляк)т закваску в количестве, соответств- ющем начальной концентрации сухих дрожжей 2 г/л и 10 н-алканов, необходимых ъ)я инициирования процесса биосинтеза.Затем начинается процесс культивирования, который протекает при тс.xературе 34 С и рН 4,5. Для регулирования величины рН и автоматического дозирования и-алкынов исполь зуют однопозиционный регулятор с заданным значением рН 4,5. Если рН культивируемой среды падает ниже 4,5, то сигнал, поступающий из рН-метра, открывает дозатор, при помоци которого осуществляют подачу смс си аммиака и н-алканов. Относпение аммиака с отдельным н-алканом рассчитыва)от исходя из выхода сухой дрожжевой биомассы 10 гл), предполагаемого содержания азоты (9,5/О), ы также коэффициента выхода (1). Готовят смесь аммиака и 800/О от расчетного кол;н тва и-ылканов. Аммиак разбавляют в 1 о. до того же объема, что и и-алканы и сИненные доза- торы вводят одинаковь 1 е объемы аммиака и и-алканов. О недостатке источника углерода в культивационной срелс свидетельствует быстрое повышение в течение 120 сек концентрации растворенного кислорода от 20 до 60",с .от концентрации пасы)пения. Используют анализатор растворенного кислорода гальванического типа.Фотоэлектрический регулятор, соединенный с кислородным анализатором, полает сигнал, который открывает клапан, регулируоци 11 введение дополнительного количества н-алканов. Дополнительно вводят примерно 20% от расчетного количества н-алканов. 11 роцссс культивирования заканчивается через 6,5 чдс, когла достигается заданный выход сухой биомассы.Полученный материал солержит 138 г сухих дрожжей, что соотвсгствхет коэффициенту выхода 1,05, 1. е. Из 1: н-длкднов получают 1,1)5 г сухого Вещества дрожжей. Полученная б)н)- масса в пересчете на сухое вецество дрожжей содержит 9,0% азота, 6,2% сырых липидов и 0,25% неиспользованных углеводородов. Сухое вещество биомассы содержит 8,2/О нуклеиновых кислот.При,ер 3. Культивирование бактерий Ме 1- Ьу)от)опав п)есапо 11 са на метаноле как единственном источнике углерода производят в том же бродильном чане, что в примере 1. Концентрация используемого метанола 98 об./.603662 фар 1(уига изобретения Составитель Г. СмирноваТс ред О. Луговая Корг)ектор А. Гриценко Тираж 568 Г 1 одписнос Редактор А. БсрЗаказ 2007/23 ЦНИИГ 1 И Государственного комитета Совста Министров (,(.(,Р по делам изооретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раугиская нао. л. 4/5 Филиал Г 11111 Гатснт, г.жгород, ул. 1 росктная, 4ПитатсльцаЯ сРеда длЯ выРа 1 пивациЯ01 гл по сухому веществу содергкит в в г):хН 1) г 80, 0 5КН,РО, 0,8МРО 4 7 Н 0 0,25Хп 804 711,0 0,00011 еС з 6 Н 20 0,008СаС 1 а 2 НО 0,0003Сц 804 5 Н 0 0,0001Мп 804 4 Н,О 0,0001СоСа 6 Н,О 0 0001К 15 л основной питательной среды добавляют закваску в количестве, соответствующем первоначальной концентрации 2 г сухого бактериал, - ного вещества в 1 л, и 10 мл метанола, необходимо для начала процесса. После этого наццнастся культивирование прц температуре 30 С и рН 60.При понижении рН среды ниже 6,0 импульс от рН-метра включает соединенные дозаторы смеси раствора аммиака н метанола. Необходимое количество аммиака и метанола рассчитывают на прирост О гл бактерий по су хому веществу, на предлагаемое содержание азота в сухом веществе биомассы 12%) и на коэффициент выхода 0,5).Для приготовления смеси метанол-аммиак берут метанола 80% от рассцетного количества и аммиака все рассчитанное количество. Недостаток источника углерода в культиваццоцной среде сопровождается быстрым повышением концентрации растворенного кислорода в течение 10 в 15 сек) с 15 до 35% от концентрации насыщения. Концентрацию растворенного кислорода в питательной среде измеряют с помощью цолярографицеского анализатора растворенного кислорода, снабженного фотоэлектрическим регулятором, который дает импульс при повышении концентрации растворенного кислорода до 30% от концентрации насыщения ца открывание вентиля для подачи метанола. Зля дополц 1 ггельцой дозир(гики используют 20% метанола от его обьцего рассцетного количества.Абсолютное колццество метанола для дополнительной дозировки составляет 60 г. Общий 5расход метанола прц культивировании составляет 300 г.Культивирование заканчивается по цстеценци 15 цас. Выход 0,48 г сухой биомассы из 1 г метанола, сухое бактериальное вегцсство содержит 13% азота, 81% сГ(рого белка и 13 го нуклеиновых кислот.Предлагаемый способ обеспечивает высокую эффективность культивирования микроорганизмов. 1. Спосоо культивирования микроорганизмов в питательной среде, содержащей кислый 20 фосфат калия, аммонцевук) соль сильной минеральной кислоты и источник углерода, прц поддержании рН путем добавления истоцника угл( рода и основания, от.гггчающгшся тем, цто, с целью повышения эффективности культцв 11 рования, рН питательной среды поддерж."ают в пределах 2,0 - 6,0 введением неорганического основания ц источника углерода, который вводят в количестве 75 - 85% от теоретически требуемого, прц этом остальное количество вводят в тецецце 5 - 120 сек с момента повышен концентрации кислорода на 10 - 80% от концентрации насыщения.2. Спосоо цо ц. 1, от,гггчаг(гшггй(я тем, ц 1 ов качестве неорганического основания исггользуют аммиак, а в качестве источника угл(рода - этацол цли н-алканы.Источники информации, нринятые во вццмаццс прц экспертизе:1. Патент Великобритании 1 Хв 1392771,кл. С 6 Г, 1974.