Штамм bacterium prodigiosum (serratia marcescens) в-ю л-1 — продуцент неспецифической эндонуклеазы

В 4 о 44 оо узна.л а ЙЮлию-,а;,1 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Соаз Советских Социалистических Республик(51) М, Кл. С 1214 1/ явлено ки единением спр Государственный комитет) Приоритет вета йкнннстров СССРо делам изобретений 6.74. Бюллетень .о 2 3) УДК 577, 5.0Опуоликовано открыт ата опубликования описания 20.0 2) Автор изобретения И, Панфилова институт цитологии и генетики Сиоирского отделения(71) Заявите. АММ ВАСТЕ 14,11.1 М РРОО С 10811 М (8 ЕККАТАКСЕЯСЕИЬ) ВЫ- ПРОДУЦЕНТЕСПЕЦИФИЧЕСКОй ЭНДОНУКДЕАЗЫ 4) палочки ытянутые,подвиж-, изиологозжижает. Изооретение относится к ооласти микро. биологии, а именно к штамму Вас 1 епцпт ргог 11 розцпт (Яегга 11 а гпагсезсепз) ВМпродуценту неспецифической эндонуклеазы.Известный штамм Вас 1 епцгп ргос 11 розцтп 5 недостаточно активно продуцирует внеклеточную неспецифическую эндонуклеазу (40 - ЧО ед/мл культуральной жидкости).Цель изобретения - увеличение активности - достигается тем, что штамм В. ргой роэцпт ВМполучают из исходного музейного штамма В, ргобровшп Впод действием нитрозометилмочевины.Для этого культуру В. ргойрозцтп Ввыращивают в среде, содержащей в 1000 мл 15 воды 22 г моногидрата лимонной кислоты, 0,5 г Ма,804, 5 г КНаР 04, 0,8 г Мд 504. 7 Н,О, 004 г ХаС 1, 0042 г Мд 804 4 НаО и 1 О г глюкозы, при рН 7,0, устанавливаемом с помощью ХН 4 ОН, до оптической плотности 20 0,65 (по ФЗК-М со светофильтром 1 че 3).Культуру охлаждают 1 час, центрифугируют (5000 об/мин, 20 лин), разводят в свежей среде до оптической плотности 0,2, вводят в среду до 0,2% нитрозометилмочевины, 25 инкубируют 15 лин, встряхивая на качалках при 30 С. Обработанную мутагеном суспензию высевают в чашки Петри с индикаторной средой, предназначенной для выявления продуцентов эндонуклеазы, содержа гцей ЗО 20,6 лг/тел рибонуклеиновой кислоты (РНК)и 0,01% толуидпна голубого, окрашивающегосреду с РНК в голубой цвет, Вокруг колоний,выделяющих эндонуклеазу, через 24 час роста в результате гидролиза РНК образуетсяореол ярко-розового цвета, Отбирают колонии с болыиими по сравнению с контролемзонами РНК-азной активности. Все отобранные варианты проверяют на эндонуклеазнуюактивность при выращивании на пептоннойсреде, что позволяет отобрать ряд мутантов,наиболее эффективно продуцирующих эндонуклеазу в среду. Наиболее активным средтнпх оказался мутант М, характеризующийся следующими свойствами.Морфология. Клетки короткиегазмером 0,8 - 3 . 0,6 - 0,8 мк; водиночные, парные или в цепочках,ные, грац-отрицательные.Культуральные признаки и фбиохимические свойства.На МПА - колонии окрутлые, гладкие,блестящие, бесцветные, диаметром 1,5 - 2;О мм(через 48 час роста при 30 С).Профиль колоний выпуклый.На РПА - колонии округлые, бесцветные, с гладкимп краями. Поверхность колоний гладкая, блестящая. Профиль колонийвыпуклый.Желатину раШтамм 1623 3947 26 - 29 64 69 28 - 79 41 - 88 39 - 79 23 - 77 Известный 1489 - 716 230 - 902690 - 1650 1800 850 в 15 191 в 9 Предлагаемый Молоко свертывает, но не пептонпзирует.Крахмал гидролизует очень слабо.Клетчатку не разлагает.Штамм является ауксотрофом, требует добавки в питательную среду серина и лизина. Из глюкозы, сахарозы, мальтозы, маннита образует кислоту, на лактозе кислота не образуется,Нитраты восстанавливает до нитритов.Оптимальный режим роста: температура 28 - 30 С, рН среды 6 - 8. При выращивании на пептонной среде штамм образует до 3600 ед внеклеточной эндонуклеазы на 1 мл культуральной жидкоП р и и е р. Штамм В. ргойроэцгп ВМвыращивают на скошенном мясо-пептонном агаре в течение 24 час, суспендируют в физиологическом растворе до плотности 1 1 Оа клеток/лгл и инокулируют в 20 мл пептонной среды в количестве 1 10 т клеток/мл среды, Инкуоируют в колбах Эрленмейера,на 100 мл в течение 65 - 70 час при 30 С. Через 16, 25, 26 - 29, 39 - 40, 47 и 64 час, отоирают по 0,5 мл культуральной жидкости и определяют внеклеточную эндонуклеазную активность. Наличие превращения РНК или ДНК 1 в олигонуклеотиды под действием культу- ральной жидкости определяют по появлению кислоторастворимого материала с абсорбцией при 260 млгк (спектрофотометр СФА, кюветы 1. = 1 см). Максимум эндонуклеазной активности наблюдается в интервале 24 - 40 час и достигает 700 - 1800 ед/мл культуральной жидкости, При выращивании мутанта в таких же условиях, но со встряхиванием на качалках (160 об/мин) или в колбах Виноградского в 20 лгл среды без встряхивания вследствие улучшенного режима аэрации эндонуклеазная активность возрастает до 3600 ед/лгл в период максимального выделения фермента (26 час роста). При измерении активности фосфомоноэстеразы за единицу активности этого фермента принимают увеличение оптической плотности на 0,1 при 400 млгк за 15 мин инкубации при 37 С. В качестве субстрата испольсти при значительном снижении активности сопутствующей фосфомоноэстеразы.Штамм устойчив в отношении эндонуклеазной активностн, При его использовании в одинаковых условиях достигается значительно больший выход фермента, чем при использовании известного штамма. Активность фосфодиэстеразы у штамма 10%, а фосфомоноэстеразы 0,13 - 0,36% от активности основного фермента. Значительное снижение активности фосфомоноэстеразы позволяет при промышленном ферментативном гидролизе РНК-ДНК получить мононуклеотиды; представляющие интерес в производстве АТФ, интерфероногенов и др.Эффективность предлагаемого штамма В, ргойрозцгп ВМпредставлена в таблице. зуют п-нитрофенилфосфат натрия и измеряют светопоглощение на спектрофотометре СФА. Предмет изобретения 20Штамм Вас 1 ег 1 цгп ргойрозцгп (Ьегга 11 агпагсевсепз) ВМ- дродуцент неспецифической эндонуклеазы. Морфология. Клетки короткие палочки размером 0,8 - 3 0,6 - 0,8 мк, вытянутые, одиночные, парные или в цепочках, подвижные, грам-отрицательные. 30 Культуральные признаки и физиолого- биохимические свойства. На М 1 ПА - колонии округлые, гладкие,блестящие, бесцветные, диаметром 1,5 - 2,0 лгм 35 (через 48 час роста при 30 С). Профиль колоний выпуклый. На РПА - колонии округлые, бесцветные,с гладкими краями. Поверхность колоний 40 гладкая, блестящая. Профиль колоний выпуклый. Желатину разжижает.Молоко свертывает, но не пептонизирует.45 Крахмал гидролпзует очень слабо.Клетчатку не разлагает.Штамм является ауксотрофом, требует добавки в питательную среду серина и лизина.431214 Составитель 3, Панфилова Техред В. Рыбакова Корректор И. Симкнна Редактор Т. Шарганова Заказ 223/473 Изд,959 Тираж 455 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Тнп. Харьк, фил. пред, Патент Из глюкозы, сахарозы, мальтозы, маннита образует кислоту, на лактозе кислота не образуется.Нитраты восстанавливает до нитритов.Оптимальный режим роста: температура 28 - 30 С; рН среды 6 - 8. При выращивании на пептонной средештамм образует до 3600 ед внеклеточной эндонуклеазы на 1 мл культуральной жидкости при значительном снижении активно сти сопутствующей фосфомоноэстер азы.