Способ культивирования гибридных клеток мыши

(57) Испнология,клетки мтательнукрови плно суспегеновцймг/мл,клеток ув ИЯ ГИ я, биотехгибридные вают в писыворотку дварительеде коллатуации 2-3 7 С, Выход а, 1 табл. тель- биоентр уадн а ва,Фь, х микроноситех в питательнойМа присутствии коллагеновы лей, концентрация которы среде составляет 2 - 3 мг/мОтличительным призн мого способа является про дирования клеток в коллагеновых микроноси концентрации 2 - 3 мг/мл.Коллагеновые микро ставляют собой порошкоо частицами размером по дл диаметром 80. - 100 мкм. л.аком описываеведение суспен присутствии телей, взятых в носители прбразную массине 180+60 мкм средой ДМЕМ ия сыворотки а 10; и гентации 0,8 мг/млванный в этой оноситель, дог/мл. Затем во ые мышиные ы их конечная ставила 5 х 10 П ри мер 1, Во флакон со стерильно после добавлен крови плодов коров из расчет мицина в конечной концентра пипеткой вносят в суспендиро же среде коллагеновый микр ведя его до концентрация 3 м флакон переносят гибридн клетки линии И КО1 так, чтоб концентрация в суспензии со ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(56) Егоров Б.Б. и др, Тезисы докл. кМахачкала,ч., с.216, 1988,Барышников А,Ю, Моноклональнытитела и ксеногенные сыворотки в дистике лейкоза и лимфосаркомы. Мо1984, с.47,Изобретение относится к биотехноло. гии и касается культивирования гибридных клеток мыши (гибридом); необходимых для производства моноклональныхантител.. Известен способ культивирования гибридных клеток мыши путем суспендирования клеток в питательной среде ДМЕМ, содержащей 10 ф сыворотки крови плодов коров, с последующим инкубированием при.37 С.Однако известный способ не обеспечивает высокого выхода клеток и продуцируемых ими моноклональных антител.Цель изобретения - увеличение выхода . гибридных клеток и продуцируемых ими моноклональных антител.Поставленная цель достигается тем, что .способ выращивания гибридных клеток осуществляют путем суспендирования клеток в питательной среде, содержащей сыворотку крови плодов коров, с последующим инкубированием при 370 С, При этом суспендирование клеток осуществляют в СОБ КУЛЬТИВИРОВАХ КЛЕТОК МЫШИользование: иммунологи Сущность изобретения: ыши ИКО, ИКОзасе ю среду, содержащую одов коров, Вносят пре ндированный в тай же ср микроноситель в конценКлетки инкубируют при 3 еличивается в 2-2,5 раз1794950 кл/мл, Флакон помещают в термостат и выдерживают при 37 С,Через 46 ч концентрация гибридныхклеток составляет 5,6 х 10 кл/мл, а титр моноклональных антител в культуральной 5жидкости - 1:50, в то время как по протоколув контроле без добавления микроносителяконцентрация гибридных клеток равна2 х 10 кл/мл, а титр моноклональных антител в культуральной жидкости 1;10. Титр антител определяют в реакции непрямойиммунофлюоресценции с использованием вкачестве антигенного материала мононуклеарных клеток периферической крови здоровых лиц,П Р и м е р 2. Во флакон со средой ДМ ЕМстерильно после добавления сывороткикрови плодов коров из расчета 10, и гентамицина в конечной концентрации 0,8 мг/млпипеткой вносят суспендированный в этой 20же среде коллагеновый микроноситель, доведя его концентрацию до 2 мг/мл. Затемфлакон засевают гибридными мышинымиклетками ИКО2 так, чтобы их конечная5 25концентрация в суспензии составила 4 х 10 25кл/мл. Флакон помещают в термастат и выдерживают при 37 С.Через 48 ч количество гибридных клетоксоставляет 4,8 х 10 кл/мл, а титр монокло 6нальных антител в культуральной жидкости 301:50, в то время как в контроле по протоколубеэ добавления микроносителя концентрация гибридных клеток равна 2,3 х 10 кл/мл,6 Формула изобретенияСпособ культивирования гибридныхклеток мыши, включающий посев клеток впитательную среду, содержащую сывороткукрови плодов коров, инкубацию при 37 С,а титр антител равен 1;1, Титр антител определяют в реакции непрямой иммунофлюоресценции с использованием в качестве антиген-положительных клеток фиксированных ацетоном тимоцитов эмбрионов человека,Обоснование выбора оптимального интервала концентраций коллагенового микроносителя представлено в таблице.Предлагаемый способ разработан в лаборатории моноклональных антител Горьковского НИ И эпидемиологии и микробиологии Минздрава РСФСР и в лаборатории полимерных носителей Научнопроизводственного Центра медицинской биотехнологии Минздрава СССР и проверен в лаборатории иммунодиагностики и диспансерного наблюдения вирусных гепатитов Горьковского НИИЭМ. Акт проверки прилагается; Планируется использование метода при крупномасштабном производстве диагностических и терапевтических препаратов моноклональных антител с испольэованием управляемого аппаратного культивирования. Предлагаемый способ позволяет повысить выход гибридных клеток и продукцию ими моноклональных антител но сравнению с известным. Кроме того, способ может быть использован для аппаратного культивирования гибридом с целью наработки массовых количеств диагностических или терапевтических моноклональных антител. о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода гибридных клеток и моноклональных антител, культивирование осуществляют в присутствии коллагенового микроносителя в концентрации 2-3 мг/мл.1794950 Конечная Примечание Титр антителШтамм гиб- КонцентраИсходная концентрация клеток,кл/мл концентрация клеток,кл/мл ридных кле- ция микроноток сителя, мг/мл Низкие титры антител 4,5 х 104,0 х 105 Ф ИКОНизкие титы антителНизкие титры антител 4,5 х 10 4,5 х 10 И КОНизкие титры антител Концентрацию клеток определяли после разрушения микроносителя раствором трипсина Титр антител определяли в реакции непрямой иммунофлуоресценции Составитель Г, БорискинаРедактор 8, Трубченко Техред М,Моргентал Корректор Т, Палий Заказ 407 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 0 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 0 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 2,6 х 10 2,4 х 10 3,1 х 10 4,0 х 106 5,6 х 10 е 1,0 х 10 е 50 х 1 У 2,3 х 10 2,8 х 10 3,5 х 10 4 8 106 4,5 х 10 1,4 х 10 2,0 х 10 1:101:11:101:501,50