Способ получения монослоя эритроцитов для иммунологических исследований

(г 9) 1 г) 6 01 М 33/49 РЕТЕНИ АНИЕ ТВ ги институт фиРабовский иМОНОСЛОЛ ЯУНОЛОГИЧЕ ение отггосится унологии, и монической диаГ- ния является Л Ь 3 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР АВТОРСКОМУ СВИДЕТ(54) СПОСОБ:. ПОЛУЧЕНИЭРИТРОЦИТОВ ДЛЯ ИМ 1СКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ(57) Использование: изобретк медицине, а имегпго к иммжет быть использовано в клиностике. Целью изобретеИзобретение относится к медицине, а именно к иммунологии,Наиболее близким техни еским решением, к изобретению является способ использования 2,5-ионена-донатора амиггогрупп для аминирования стекла.На обезжиренную стеклянг:ую поверхность чащек типа "Орион" наносят 2,5,4. ный водный раствор 2,5-ионена с ФЗФ (рН 7,4) в количестве 4 мл га одну чашку, Э кспозиция с целью электростатического. прикрепления поликатиона к стеклу составляет 2 ч при комнатной температуре. После экспозиции поликатион сливагот, чашки отмывают ФЗФ без поликатиогга и наносят на них 4,-нуго взвесь опгытых эритроцитов в ФЗФ; Экспозиция прггкрапле 1 гггя эритроцитов составляет 45 мин при комнатной температуре, После экспозиции эритроцитарной взвеси чашки тщательно отмывают 2ускорение и улучшение качества целевого продукта. Сущность изобретения заклгои- ется о обработке поверхности стекла водным раствором аминиругощего агента, его эксплуатации и последугощим нанесении на него взвеси эритроцитов, последугощей инкубации и отмывки, причем в качестве аминирующего агента использугот 2,5";6-ггый раствор у-амиггопропилтриэтоксисилагггг, экспозицию осуществляют при температуре 100 С в течение 15 мин, а инкубаци,о эритроцитов - в течение 5-10 мин, Положительный эффект заклгочается в ускорении процесса в 4,5 раза с сохранением 09 , жизг ееп особ н ых клеток. для удаления неадгезированных эритроцитов,Полученный монослой используют согласно поставленной цели. Время получения монослоя составляет 3 ч. Прикрепление эритроцитов к стеклу происходит вследствие того, что суммарный заряд стекла является отрицательным, поликатион заряжен положительно, поверхность эритроцита суммарно заряжена отрицательно.Однако в известном способе получения монослоя эритроцитов имеготся существенные недостатки, .Прикрепление эрггтроц)гтов к поверхности стекла надостзтогно прочное, поскольку нанесение на поверхнось стекла 2,5-ионена предполагает образование двух слоев электростзтичес;их связей: первый слой - отрицательно ззряжеггггь,е группировки стекла и пологг 1 ггтельно ззрях:еггные группы -,Ь-иоггана, второи слои- отрицательно заряженные группировки эритрацитов и положительно заряженные группы 2,5-ионена. Два слал зарядов не обеспечивают прочность фиксации клетки к стеклу, поэтому для сохранения целостности монослоя требуется особая осторожность при отмывании его от эритроцитов буфером, особая осторожность при наслоении лимфацитов на монослай и отмывание от непрекрепившихся лимфацитов, Несмотря на это, добиться образованиясплошного монослоя на 100;6 поверхности стекла все же не удается. Все это создает трудности работы с монаслоем, увеличивает материальные и временные затраты на получение монослоя, превышающие обычные для этого метода 3 ч. В итоге трудоемкость получения монослоя велика. Кроме тога, стоимость препарата достаточна высока - для обработки одной чашки требуется реактив стоимостью около 25 долларов,Цель изобретения - ускорение и улучшение качества целевого продукта.Указанная цель достигается использованием в качестве донатара аминогрупп для получения положительно заряженной поверхности стекла рф-аминопропилтриэтоксисилана,Способ осуществляется следующим образом.На тщательно обезжиренную стеклянную поверхность чашки Петри наносят 5-10 мл 2,5 о-ного водного раствора у-аминапропилтриэтоксисилана. Чашку помещают в суховаздушный шкаф при 100 С на 15 мин.После прогревания раствор -аминапропилтриэтоксисилана сливают и он может быть испальзооан многократно, Чашку промывают тщательно дистиллированной водой и два раза ФЗФ (рН 7,2-7,4), На подготовленную таким образом стеклянную поверхность наносят 4;-ную взвесь отмытых эритроцитов любого животного или человека, Объем эритроцитарной взвеси составляет 4-10 мл.Экспозиция для связывания эритроцитов составляет 5 мин. Неадгезирооанные эритроциты тщательно отмывают ФЗФ (рН 7,4). Полученный манослой эритроцитоо готов к использованию в зависимости от поставленной цели. Время получения моно- слоя предлагаемым способом составляет 35-40 мин, Качество получаемого монаслая определяется под микроскопом при увеличении объектива о 200 раз(отмечается наличие свободно плаоающих в растворе эритроцитов, непрерывность монаслоя в полях зрения, Качество монослая отмечается знаками;с т о к л . а э Р т р о ц и т С целью отработки оптимальных режи 45 моо для получения эритроцитарного монослоя от морской свинки использовали 1; 2,5;5; 10; 25;-ные водные растворы 1 аминапропилтриэтоксисилана с целью аминирования поверхности стекла. При этом50 концентрация эритроцитарной взвеси морской свинки осаваас посояной.В дальнейшем были использованы различные временные интервалы процессааминираоания. 2, 5, 15 и 30 мин и темпера 55 тура 100 и 22 С,Для определения длительности инкубираоания ЭУС на аминирооанной поверхности стекла задавались временные интервалы:5, 10, 20 и 45:,ин при сохранении постоянства орсмш;и и температуры аминирооания,-неудовлетворительный монослой (занимает 40 площади стекла, в полях зренияплавающие эритроциты).+манослой занимает 80;6 площади 5 стекла, в полях зрения плавающие эритроциты.монаслсй занимает 100 площадистекла; в полях зрения плавающие эритро-.циты отсутствуют,10 7 -Аминопропилтриэтоксисилан используется для создания ковалентно-закрепленных аминогрупп на силанольнойповерхности (силахрам, силикагель, пористое стекло и др,), что позволяет в15 дальнейшем использовать их как оснооудля модификации с целью иммобилизациибелков.Таким образом, у-аминопропилтриэтоксисилан применяется для приготовления 20 сарбентоо на основе силохромовых матриц.Использование "аминапропилтриэтоксисилана с целью получения манослая клетокнеизвестно.Предложенное вещество обеспечивает 25 модификацию стекла таким образом, чтоаминогруппы находятся в прочной ковалентной связи с ним и о несколько раз большемколичестве на единицу площади. Этим объясняется поочнасть прикрепления эритро цитов к стеклу, так как связь представляетсобой не два слоя электростатических взаимодействий, а лишь один:концентрации эритроцитарной взвеси итемпературы инкубирования.Таким образом, оптимальными режимами получения эритроцитарного монослоя настеклянной поверхности являются использование 2,5 о-ного водного раствора у-аминопропилтриэтоксисилана с цельюаминирования стекла при 100 С в течение15 мин с последующей отмывкой и нанесением 4%-ной эритроцитарной взвеси при 1022 С в течение 5 мин. Использование меньших концентраций и температур снижаеткачество монослоя, а повышение используемых концентраций приводит к непроизвольному расходу реактивов. 15Предлагаемый способ получения монослоя эритроцитов может быть использовандля выделения спонтанных розеткообразующих лимфоцитов у крыс.Известные способы выделения спонтанных РОК не позволяют получать их внеизменном виде и в достаточном количестве.Предлагаемый способ получения монослоя эритроцитов позволяет получать достаточное количество немодифицированныхРОК крысы,П р и м е р, Лимфоциты тимуса, селезенки, лимфатических узлов брыжейки тонкойкишки, пеоиферической крови в концентрациях соответственно 5,3,3,2 10 кл/мл в объ 6емах по 10 мл наслаивают на монослойэритроцитов, полученный предлагаемымспособом. Инкубируют чашки Петри 30 минпри комнатной температуре, затем 1 ч при 354 С в присутствии 20%-ной декомплемейтированной сыворотки морской свинки. Лимфоцитэрную взвесь сливают, чашкитщательно отмывают средой 199 от непрекрепившихся лимфоцитов к монослою. монослой лизируют 2 мл дистиллированной водыв течение 15 с, разводят избытком среды,отмывают один раз этой же средой. ресуспендируют клетки в объеме 1 мл этой же среды, подсчитывают снятые с монослоя лимфоциты в камере Горяева. Подсчет ведут в 100 больших квадратах камеры и производят перерасчет на 1 мкл.Повторное розеткообразование с лимфоцитами, выделенными с монослоя эритроцитов, составило 95 РОК.Таким образом, предлагаемый способ получения монослоя эритроцитов отличается от известного сокращением в 4,5 раза времени получения монослоя, снижением трудоеМкости процесса. Способ позволяет получать высокое качество монослоя эритроцитов, снимать с монослоя достаточное для использования число клеток лимфоидных органов, используя феномен розеткообразования. Стоимость предлагаемого реактива в 100 раэ меньше, чем у известных способов см. таблицу)..Анализ жизнеспособности клеток селезенки, снятых с эритроцитарного монослоя, определяемой с помощью 0,5%-ного раствора трипанового. голубого, выявил 99% жизнеспособных лимфоцитов. Ф о р мул а изобретен ия Способ получения монослоя эритроцитов для иммунологических исследований путем покрытия поверхности стекла водным раствором аминирующего агента, его экспозиции и последующегонанесения на него взвеси эритроцитов, инкубации и отмывки, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения и улучшения качества целевого продукта, в качестве аминирующего агента используют 2,5%-ный раствор -аминопропилтриэтоксисилана, экспозицию осуществляют при температуре 100 С в течение 15 мин, а инкубацию эритроцитов - в течение 5-10 мин,