Способ определения нарушения функционального состояния мембран кардиомиоцитов

(51) ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР НИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ИС ТОРСКОрсон и ,т. И 1,Изобретение относится к эксперимен- фракцию мембран инкубирувт с субстратом тальной медицине и может быть использо- (АТФ) и исследуют фотоколлориметрически вано для выявления нарушений и активность йа, К, АТФаэы. По накоплению повреждениймембранкардиомиоцитовпОд: неорганического фосфата, который являет- действием экстремальных факторов, атак- ся продуктом гидролиэа АТФ, судят об акжескринингефармакологическихпрепара- тивности мембраносвяэанного фермента, тов, - снижение которого является показателемИзвестен способ оценки функционала- .нарушения функционального состояния ного состоямия мембран кардиомиоцитов, мембран.основаннв)й на комплексном исследовании, Наиболее близким является способ реа имвнно выявлении нарушений структуры " гистрации активности и термоийактивации сарколеммы, определении активностй мем-Иа, К, АТФазы. При этом миокардиальную браносвязайной йа, К. АТФазы, а также йа- ткань дваждй гомогенизируют, гомогенат руаенйи резузл+ьтатов их деятельностй. - . фильтруют и суспендируют в среде, содернакоплейия Са в цитозоле кардйомицитов. жащей 20 мм имидаэола, 20 мм пирофосфаДля этого наввску ткани миокарда гомогени- та натрия, 1 мм ЭДТА и имеющей рН 7,8 и зируат для выделения срколеммальной температуру 4 С. Осадок промывают, осажфракции фермента, гомогениы подверга)ет дают и суспендируют в среде хранения. дадренциальному центрифугировани 1 О, ЛеЕ оценивают йа, К. АТФазную активность(21)4777067/14 . ранную разность потенциалов кардиомио- (22) 02.01.90 цитов в питательной среде при температу- (46) 23.07.92, Бюл. Ь 27 ре, оптимальной для жизнедеятельности (71) Иркутский государственный медицин- преперата; затем препарат"поТйещают в ский йнстйтут-, аналогичную питательную среду с темпера- (72) И.Л.Ясинский, Ф.З.Мее В.в.ма- турой 3-4 С, инкубируют в ней в течение 90+ лышев 5 мин. Повторно измеряют трансмембран- (56) Бюлл. зксп. биол., 1986 Ь 12, с, ную разность потенциалов, после чего пре-687.: парат возвращают в исходные условияперфузии, регистрируют дийамику восста- (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАРУВЕ- новления трансмембранной разности по- НИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ тенциалов; по которой устанавливают МЕМЬРАНКАРДИОМИОЦИТОВвеличину и времй ее полумаксймального (57) Использование; экспериментальная ме- восстановления. Рассчитывают скорость дицина. Сущность изобретения:и ч 1 тго рв- восстановления трансмембраййой раэногестрируют . изменения активности, сти потенциалов и по ней опоеделяютсостомембраносвязанноййа, К,АТФазы,длячего, йние нарушенйй функции мембраны З сначала определяют исходную трансмемб-кардиомицитов,опытных и контрольных образцов, Оценкуфункционального состояния мембран проводят путем регистрации изменений активности йа, К, АТФазы в результатеопределения кинетики ее термоинактивации. Для этого по мере инкубации мембраносвязанного фермента при 52 ОС в течение 2ч исследуют активность йа, К, АТФаэы. Возрастание скорости термоинактивации вопытных пробах, по сравнению с контролем, 10свидетельствуют о повреждении мембраносвязанного фермента и, следовательно, о нарушении функционального состояниямембран кардиомиоцитов. Однако даннаяметодика неспособна оценить ФС мембран, 15изменение которого может реализоватьсяпри воздействиях без нарушения конфор мационной стабильности фермента и изменений кинетики его термоинактивации,Целью изобретения является повышение тонкости способа и его упрощение,Для этого сначала определяют исход-ную трансмембраниую разность потенциалов кардиомиоцитов в питательной средепри температуре 32 С - оптимальной для 25жизнедеятельности препарата 1 п чего. Затем препарат помещают в среду с3-4 С,инкубируют и повторно измеряют трансмембранную разность потенциалов, Далеепрепарат возвращают в исходные условия 30жизнедеятельности и регистрируют динамику восстановления трансмембраннойразности потенциалов, по которой устанавливают величину и время ее полумзксимального восстановления; Скорость 35определяют по формуле .Легде Ь е - изменение трзнсмембранного потенциала эа время; 40- время, в течение которого наступаетполумзксимзльное восстановление потенциала,Оценку функционального состояниямембран кардиомиоцитов проводят по отношению скорости полуйексймэльного восстановления опытного к контрольномупрепарату и при значении полученного отношения. 1,0, определяют нарушение функциональибго состояния мембран 50кардиомиоцитов,П р им е р. Обьектомоцеики ФСмембрзн кардиомиоцйтов являетсю препарат папиллярной мышцы, выдвленйый из левогожелудочка сердца крысы. Крысу нэркотизируют, сердце извлекают, з папиллярнуюмышцу препарируют в охлажденном до 34 С растворе Кребсэ.Хеизелейта. Для осуществления способа используют мыацы сдиаметром 0,5-0,7 мм и длиной не менее 5 мм, Препарат помещают в кювету, черезкоторую протекает со скоростью 25-30мл/мин. раствор Кребса-Хензелейта, имеющий состав, мм: йаО 118; КО 4,8, СаС 1,6;КНгРОа 1,2; Мд 80 ф 2.4; йаНСОз 25,2; глюкоза 11,0. Раствор оксигенируют смесью Ог -95 и СОг - 5 до насыщения его Ог 500 -550 мм рт.ст. и установления рН 7,35. Раствор подают в термостатированную при 32+0,1 ОС кювету, а его избыток возвращают воксигенератар с помощью непрерывно работающего перистальтического насоса.Фиксированную в кювете папиллярнуюмышцу, стимулируют надпороговыми прямоугольными импульсами с частотой 1 Гц,После стабилизации деятельности препарата в течение 15 мин осуществляют проведе-.ние способа,Для отведения трансмембранной разности потенциалов используют метод микроэлектродной техники и стеклянныемикроэлектроды с диаметром кончика неболее 0,5 мкм и собственным сопротивлением 20-30 мОм, Траисмембранные потенциалы подавали на вход усилителя постоянноготока с входным сопротивлением около 20ГОм и далее на осциллограф.Трансмебраиный потенциал регистрируют до холодовой инкубации при температуре 32 С, в конце холодовой инкубациикзрдиомиоцитов при 3-4 ОС и далее непрерывно при реперфуэии препаратов в питательной среде с температурой 32 С. Порезультатам их измерений строят кривуюдинамики восстановления Е, рассчитываютскорость его пояумаксимэльиого восстановления и вычисляют Е 12 ис т е., если Емин" 68 МВ, Емас 10 мВ, то Е 1/2 макс "Ецио + Ема 85 5 В2Далее относительно величины Е 1/2 мана оси абсцисс графика определяют границы интервала времени 1 - 0,5 мии, откладывают перпендикуляр нэ кривую грэфмка, аот границ выделенного участка кривой -перпеидикуляры из жь ординат, то отрезокна оси ординат составит Ье за время т. Вслучае, если Ьа будет равна 12 мВ, то скорость полумаксимзльного восстановленияЕм аостэвйт:У -. Ям мВ/мин.Велйчинз в Е, полученная по кривой переходного процесса восстановления Е отражает данный параметр у интактныхкардиомиоцитов (контроль). После 5 ч стресса, рассчитанные аналогичным способом переходные параметры восстановления, составляют1749832 Составитель СУябов Техред М.Моргентэл Редактор М,Бланар Корректор М,Шароши Заказ 2593 . Тираж . Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Рауаская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Енин 38 МВ 1 Емакс 69 МВ Е 1/2 мекс53,5 мВ, Е эа 0,5 мин - 1,5 мВ, тогда У9 мВ/мин,4,50,5Для расчета ИФСИ вычисляют отноаение величины Ч, е (9 мВ/мин) опытногопрепарате к ее значению в контроле (24мВ/мин), т.е.ИСМ - -" - " - " - ". -- О Зу контрольного 2410Таким образом, предлагаемый способпозволяет повысить точность определениянарушения функционального состояниямембран кардиомиоцитов. Способ прост,так как в принципе основан на одном приеме - . измерении Е в течение 1,5 - 5 мин,Предлагаемый способ может быть широкоиспользован и практике экспериментальных исследований нарушений функциональногосостояния мембран кардиомиоцитов. а 20именно изучении патогенеза поврежденийи нарушений деятельности мембран кардиомиоцитов, разработки способов профилактики заболеваний сердечно-сосудистойсистемы, сопровождающихся нарушениями 25и повреждениями мембран кардиомиоцитов,в поиске эффективных медикаментозныхсредств, предупреждающих эти нарушения,а также скрининге фармакологических пре 30 паратов, для выявления и оценки их влияний на мембрану и мембраносвяззнную Мэ, К, АТФазу кардиомиоцитов.Формула изобретенияСпособ определения нарушения функционального состояния мембран кэрдиомиоцитов путем регистрации изменения активности мембраносвязанного фермента, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа и его упрощения, регистрируют трднсмембранный потенциал кардиомиоцитов йри 32 С, затем охлаждают препарат до 3-4 фС, инкубируют его, вновь измеряют потенциал, возвращают препарат в исходные условия, регистрируют динамику восстановления потенциала, рассчитывают величину скорости ч его полумвксимального восстановления по формулеч-Ьей,где Ье - изменение трвнсмембранного потенциала за время ф;,- время, в течение которого наступает полумзксимзльное восстаювление потен-. циала,затем рассчитывают отношение полученного показателя к таковому в контроле и при значении полученного отношения менее 1,0 определяют нарушение функционального состояния мембран кэрдиомиоцитов,