Способ идентификации в-лимфоцитов кур

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 80168467 48 51)5 С 01 ЕТЕНИЯ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 38 Бюл. Уный научи рный инс: Г 1 ир,В-ЛИИФОЦИ НТИФ вете и обретение относится в частности к спосо итета птиц, и может овано в ветеринарно иагностике для оцен олиферирующих клето нтител. у оценки быть Ис- клиничесрии,иммуполькой и активно дуцент ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЭ(54) СПОСОБ ИДЕТОВ КУР лью изобретения является повь шение производительности способанаглядности.Способ осуществляется следующим образом.Для выделения лимфоцитов кур берут в орошенную гепарином пробирку кровь в объеме до 2 мл, наслаивают на фикол-урографиновый градиент И1,082) в соотношении 2:1 и центрифу. гируют при 350 я в течение 40 мин.Лнмфоциты отбирают иэ интерфаэы, трижды отмывают средой 199. Осадок лии 5 оцитов сохраняют при температуор -20 С.(57) Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способу оценки иммунитета птиц. Цель изобретения - повышение производительности,способа и наглядности. Для этого иэкрови выделяют суспензию лимфоцитовпроводят кх электрофореэ в геле, окрашивание фракций щелочной фосфотазы, после чего проводят идентификацию В-лимфоцитов по окрашенной медленной фракции иэофермента щелочнойфосфатаэы. Учет результатов ведутпо балльной оценке интенсивности окрашивания. Для проведения электрофореза к 0,05 мл осадка лимфоцитов добавляют равный объем среды следующего соста-, ва: 603 сахарозы, 17. тритона .Х, 1 кристалл броикрезолового красного и вьдерживают 5-10 мин при комнатной температуре. Затем образцы лимфоцитов наносят на столбики с 4 Е концент- р, рацией акриламида на трис-НС 1 буфере р, (рН 6,7) с добавлением 1 Х тритона .Хи разделяющего геля с 9 Х-нойконцентрацией акриламида на трис-НС 1- фф 1 буфере рН 9,6 с добавлением 1 Х тритона Х,Разделение белковых молекул проводят 240 мин. При силе тока 2-3 мА/ /трубку в электродном буфере рН 8,6 файф следующего состава : 1,2 г .гидрооки- си лития; 11,8 г борной кислоты; 2 ОдО ип дистиллированной воды.По окончании электрофореза дляокрашивания образцов гели извлекаютиз трубочек и переносят в кювету синкубационной средой следующего состава: 5,0 мг нафтол-Аз-ИХ-Фосфат;0,25 мл диметилсульфоксид; 25 млвероналацетатного буфера рН 9,2;25 мг прочного синего ББ.Гели инкубируют с сывороткамикрови в течение 20 мин при 37 С собразцами лимфоцитов в течение 24 чв холодильнике.Учет результатов проводят визуально. Иаксимальная интенсивностьокрашивация обозначается как "и далее по степени снижения интенсив: -НОСТИ ВЫ 1 тажавт КаК , "+" И ОтСУтствие окрашенной полосы отмечаетсятт ттП р и м е р 1, Идентификж;ия помедленному изофермецту щелочной фос 4 о тазы В-лимфоцитов.Готовят суспензию лимфоцитов -.дневных ттыплят следующим образом".кровь с гегарином в объеме до 2 млнаслаивают ца фикол-упрографицовыйградиент (с 1 = 1,082) в соотношении2:1 и цецтрифугируют при 350 я 40 мин,111:Фоптттты трижды пр эттывают средойот 99, с.хр;цлют при температуре -20 С,татом .; 50 мкл осадка лимфоцитов добавля,дт ра;,ый обем среды, содержатцей Ьт)Х сахарозы, 17, тритотта Х 1 кристалл бромкрезолового красного.Через 5-10 ттитт ттаносят на столбики4 Х конце ттрируюшего геля (трис - НС 1,. рН 6,7, с цоттавлеттием 17 тритонаХ) и 9.-. разделятотяего геля (трисНС 1, рН 9,6 с добавлением 1 Х тритона Х).,Разделение белковых молекул проводят 240 миц при силе тока 2 - 3 мА/труб ку в электродном буфере гидроокись -лития - борная кислота (соответственно 1,2 .г и 11,8 г на 2000 мл воды)рН 8,6,После окончания электрофорезагель извлека 1 от и окрашивают 24 члрн 4 С в среде, содержащей 5,0 мгнаттол-Ав-МХ-Фосат; 0,25 мл диметвп. сульлоксттд, 25 мл веронал-г цетатцогобуфера, рН 9,2; 25 мг прочного сине; о ББ. Гель сохранялся в 77-ном растворе уксусной кислотыДля получения электрофореграммыщелочной Фосфотазы сыворотки крови55поступают следуктщим с бразом, Кровьв объеме 1 мл после отслаивания сгуст.ка цен 11 тифугирутттт 15 мин при 350 я,затеи к 50 мкл лтбавляют равный обьем среды следующего состава; 607 сахар азы, 1 М тритона Х, 1 кристаллбромкрезоловогтт красного. Далее через 5-10 мин наносят на столбики сг лем и т.д. аналогично описанногов тше.После окрашивания оба столбика сгелем анализируют и цаблюдают наличие линии спектра синего цвета содинаковой пттдвижностью. Следовательно, медленный изофермент щелочнойФосфатаэы спектра сыворотки кровисоответствует очищенным В-лимфоцитамцыплят.В пробе сыворотки крови дополнительно наблюдалась быстрая фракциящелочной Фосфатазы.П р и и е р 2. Влияние ингибиторабурсы циклофосфана на спектр щелочнойФосфатазы сыворотки крови,Суточным цыплятам в течение трехдней вводят циклофосфан (ицгибиторбурсы) в дозе 60 мг/кг. В возрасте6 дней исследуют электрофореграммулимфоцитов переферической крови,С этой целью кровь с гепарином вобъеме до 2 мл оерут от контрольныхи опытных цыплят, наслаивают ца фикол-урографиновый градиент И = 1, 082)в соотношении 2:1 и центрифугируютпри 3508 40 мин. Затем трижды промывают срецой 199 и сохраняют принеобходимости при температуре -20 С,оЗатем к 50 мкл осадка лимфоцитов добавляют равный объем среды, содержащей60/ сахарозы, 1 л тритонаи т.д.,аналогично описанного в примере 1.После окрашивация анализируютстолбики гелей контрольной и опытной групп. В контроле получают аналогично примеру 1,окрашенную синююполосу, а в опытттых столбиках - либо следы от соответствующих линийв контроле, либо вовсе отсутствие окраски.Татим образом, иммунодефицит В-лимфоцитов, вызванный циклофосфаном, регистрируется при цитохими"оком окра -и.иВаттии электрофореграмм из проо лимфоццтов крови птиц.Способ является микрометодом, таккак достаточно 50 мкл исследуемого1 атериала (лимФоциты, сыворотка крови) Способ позволяет откалиброьатьитттецт ивность слабовыраженцого изоФЕРМЕНта ,"+") КаК СООтВЕтСтВУЮтт 1 ЕгЕ0,5 мкг;.елка, не требует наличияспец 114 зи тес ких ацтисывороток тт пос -Заказ 3502 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 тановки опыта в день взятия крови, окрашивание может быть проведено сроком до 8 дней, доступен для интерпретации результатов сразу после цитохимцеского окрашивания.Производительность способа ограничена лишь конструкцией аппарата для проведения электрофореэа (14-24 столбиков с гелем), тогда как при технике микроскопирования в день можно сделать заключение о 10-12 мазках в день.Способ имеет безусловное преимущество в иллюстративности материала и позволяет быстро и наглядно оценить состояние В-иммунитета птиц. 4 б 73 6 формула изобретенияСпособ идентификации В-лимфоцитоз кур, включающий получение пробы 5крови, окрашивзние лимфоцитов на щелочную фосфатаэу и учет результатов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения проиэнодитель ности и наглядности способа, иэ крови выделяют суспензию лимфоцитов, проводят злектрофорез в геле и идентификацию В-лимфоцитов ведут по окрашенной медленной фракции изофермента щелочной фосфатазы, а учет разул- татов осуществляют по балльной оценке интенсивности окрашивания .