Способ обработки электрофореграмм

(51 Й 01 Й 27 ГОСУДА ПО ИЗО ПРИ ГКН ТВЕННЫЙ КОМИТЕТЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМСССР Б ТЕН АВ аенко биохимии и биохимичехи) ических имо примепосредтвом изобретения ости опреде- аэделяемых злишние расход его времени, овия окрашива- л проек форег иохимии и биохимичехимическихпищевой,евтической биогехноех случаях, одов раздеэа в гелях. ься в ких, ской рмаци, при во вс е метофоре рамм и фиг, 1 - 16 (А), 20 (Б) и г. 2 - 16 (А), 12 (Б) и 26,8 емя выдери 35 (В) ч, фч С щипособ может м образом. ля каждой си войства и раз ес 1 ВО фрдкц тер и концен варительно о ствлен сл ыть ос е особенностяособенности и темы с е ми (с коли харак пред меры геля ионируем трация кр пределяю о мд 1 ериала Р точностЙ экономи е ен(71) Ленинградский медицинский институтим. акад. И.П. Павлова и Витебский медицинский институт(54) СПОСОБ ОБРАБОТКИ ЭЛЕКТРОФОРЕ гРАММ(57) Иэобрете; ие относится кхимии, может использоваться вских, клинико-биохимических иисследованиях, когда необходнение методов разделенияэлектрофореза в гелях. Цельзаключается в повышении точнления электрофоретических р Изобретение относит химии и может испольэова ских, клинико-биохимиче исследованиях. в химич парфюмерной, химико- б отраслях промышленност логических производствах где необходимо применен ления посредгтвом электр Целью является повьопределения при сдновре реактивов. компонентов. Цель достигается благодаря точности предварительного определения минимально необходимого времени прокрашивания гелевых электрофореграмм, обеспечивающего обязательное полное окрашивание этик электрофореграмм путем прокрашивания одинаковых гелевых электрофореграмм в одинаковых условиях при разных выдержках (т 1 и тр), фотографирование гелевьх электрофореграм)1, измерение на полученных фотопроекциях площадей(5 и 52) зон, ограниченных контуром наиболее интенсивной окраски, и определение минимально необходимого времени прокрашивания по формуле ъ ин =(5112-52)/(51 - 52), Способ позволяет точно определить количе- ф ство и соотношение разделенных электрофорезом фракций, минимально необходимое время полного прокрашивания электрофореграмм, предотвращает ды реактивов и рабо позволяет варьировать ус ния электрофореграмм. 2 и На фиг, 1 и 2 редставлены фокрашенных гелевых элек5 10 15 20 25 30 35 40 45 5 10 необходимое время инкубации (прокрашивания) разогнанных электрофореграмм в данном растворе красителя, Для этого две электрофореграммы с расфракционированным материалом, представляющие собой гелевые столбики (ГЭ 1 и ГЭ 2), выдерживают в растворе красителя в течение времени, соответственно 11 и 12 (причем 11 Х 12, например т 2 = 1,2-1 2511, и наоборот), Затем ГЭ 1 и ГЭ 2 отмывают обычным способом от излишков красителя (ц местах, свободных от фракционируемого материала) и фотографируют. На полученных фотопроекциях (фиг, 1 и 2 А и Б) с помощью палетки со стороной квадрата в 1 мм, определяют площади неокрашенных зон по внешней границе замкнутой кольцевой (овальной или грушеобразной) зоны 1, ограниченной усиленно "окрашенным" контуром (соответственно 51 и 52). По площади указан. ных зон и соответствующему им времени выдержки ГЭ в растворе красителя (соответственно 11 и 12) рассчитывают минимально необходимое время (тмин) для полного прокрашивания ГЭ в конкретных условиях по формуле5112 - 5201 мин =П р и м е р. Все использованные в эксперименте гелевые электрофореграммы (ГЭ) представляли собой столбики 15)ь-ного полиакриламидного геля (содержащего 2,5 М мочевины) высотой 100 мм и диаметром 6 мм. В каждом столбике предварительно было осуществлено с помощью электрофореза (в идентичных условиях) фракционирование 40 мкг тотальногп препарата гистонов тимуса теленка. Фракционирование осуществляли в течение 2,5 ч при силе тока 1,8-2 мА с использованием модели прибора 73 для электрофореза фирмы "Реанал" (Венгрия), а в качестве электродного буфера - 0,9 М раствора уксусной кислоты (рН 3,2),Каждую из полученных описанным способом ГЭ помещали для окрашивания в 10 мл 0,057 ь - ного раствора Кумасси бриллиантового синего, растворенного в смеси изопропанола и 0,9 М уксусной кислоты (в обьемном соотношении 1;3).Две идентичные гелевые электрофореграммы - ГЭ 1 и ГЭ 2 - выдерживали в растворе красителя соответственно 16 и 20 ч, где 16 ч - время 11, а 20 ч - время 12, Таким образом, 11 = 16 ч - это время, рекомендованное литературой, а т 2 со тавляет 1,2511. Затем ГЭ 1 и ГЭ 2 отмывали обычным путем от излишков красителя (в 0,9 М уксусной кислоты), Полученные ГЭ 1 и ГЭ 2 имели вид,представленный соответственно на фиг. 1 А и 1 Б. ГЭ 1 и ГЭ 2 фотографировали и на их фотопроекциях определяли соответственно 51 и Я 2 - площади тех зон расфракционированноо гистонового материала, которые ограничены контуром наиболее интенсивной окраски. включая площади полосок собственно контура, обозначенных стрелками на фиг, 1 А и 1 Б, При измерении площадей (51 и 52) пользовались палеткой со сто вроной квадрата 1 мм. Минимально необходимое время прокрашивания ГЭ-м рассчитывали по формуле: 5112 3211 1 мин -51 - Яг 64,0 мм х 20 ч - 50,0 мм х 16 ч 343- 34,3 ч 64,0 мм - 50,0 ммПосле этого осуществляли прокрашивание ГЭ в избранных условиях с учетом того, что, минимально необходимое время прокрашивания составляло 34,3 ч, Полученные таким образом ГЭ имели вид, представленный на фиг. 1 В (т. е. были полностью прокрашены),На таких электрофореграммах разделение компонентов гистонового материала было четко видно и было представлено четырьмя основными фракциями, отсутствовала неравномерность окрашивания, в том числе и за счет исчезновения "контурных" границ.Способ позволяет варьировать условия окрашивания электрофореграмм в зависимости от особенностей эксперимента (характер геля, фракционируемого материала, красителя, и т. д.) и позволяет сделать выбор между экономией красителя за счет увеличения длительности прокрашивания или экономией времени за счет повышения концентрации красителя в окрашивающем растворе, Таким образом, предлагаемый способ гарантирует правильность выявления фракций злектрофоретически разделяемого материала за счет обеспечения полноты их окрашивания. Формула изобретения Способ обработки электрофореграмм путем их окрашивания, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности определения при одновременной экономии реактивов, окрашивают две одинаковые гелевые электрофореграммы в одинаковых условиях при разной выдержке в растворе красителя, фотографируют отмытые гелевые электрофореграммы, на полученных фотопроекциях измеряют площади зон, ограниченные контуром наиболееА Ге 1 Фиг СоставительРедактор Н, Горват Техред М.Мо Корректор Н. Ревс И. Рогальргентал каз 337 Тираж 395 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж. Рэушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент". г, Ужгород, ул.Гагарина, 10 интенсивной окраски, и минимально необходимое время прокрэшивания рассчитывают по формуле112 Я 2 т 1тмин где Б и 52 - площади зон, ограниченных контуром наиболее интенсивной окраски, на фотопроекциях гелевых электрофореграмм при выдержке в красителе соответст вЕннО 11 и 12,