Способ получения растений-регенерантов чая

(51)5 А 01 Н 4/00 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ енное м куль- логии аГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Всесоюзное научно-производстобъединение по чаю и субтропическитурам и Институт молекулярной бии генетики АН УССР(56) Авторское свидетельство СССРМ 1311673, кл, А.01 Н 3/00, 1985. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции и семеноводстве ( в частности, в работе по созданию искусственных семян), в исследованиях по физиологии, эмбриологии и морфогенезу растений. Цель изобретения - ускорение получения регенерантов и повышение их выхода.Способ состоит в том, что недозрелые коробочки с семенами чая стерилизуют путем. погружения на 3 - 5 с в 96 этиловый спирт с последующим обжиганием в пламени спиртовки, в асептических условиях проводят снятие наружных покровов с семени, вырезают половой зародыш, каждую семядолю разрезают на четыре фрагмента и помещают на искусственную агаризованную питательную среду(0,5 - 0,6;4-ный агао), содержащую макро- и микроэлементы по прописи Гамборга В 5 и дополненную 6-бенэиламинопурином (2 мкмоль) и а -нафтилуксусной кислотой(10 мкмоль), Культуральные сосуды с эксплантатами помещают в усло(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ - РЕГЕНЕРАНТОВ ЧАЯ(57) Изобретение относится к биотехнологии и может применяться для ускоренного получения большого количества растений чая, Целью изобретения является ускорение получения регенерантов и повышение их выхода, Способ состоит в том, что регенеранты чая получают на питательной среде, за основу которой взята пропись Гамборга В 5 при строгом соблюдении режимов культивирования, чередования световой и темновой фазы и фитогормонн;:,х добавок, 3 - бл,вия темноты и инкубиру.от при 25+1 С в течение 15 сут. затем переносят в условия освещения: освещенность 2 - 4 лк, фотопериод 16/8 ч, температура та же, Через 30-40 сут из зксплантата разви,ается быс;рорастущая эмбриогенная каллусная масса. Помещая эмбриогенный каллус на ту же среду, но с уменьшенным вдвое содержанием регуляторов роста, через 15 - 20 сут наблюдают образование соматических эмбриоидов, которые в процессе своего развития проходят все стадии, присущие развитию зиготических зародышей: глобулярную, сердечковидную торпедовидную и семядольную. Рмбриоиды на семядольной стадии развития помещают на 1/2 состава среды Гамборга ВБ, дополненную 1 мкмоль 6-бензиламинопурина и 5 мкмоль р -индолилмасляной кислоты, культивируют в тех же условиях освещения. Наблюдают развитие у соматических эмбриоидов корней и побегов. Через 30-35 сут образуются проростки чайных растений, которые" переносят в почву.За один цикл выращивания из эмбриогенного каллуса, полученного от одного фрагмента семядоли, формируется 30 - 50 соматических эмбриоидов, 80-90 О которых последовательно развивается в растения. С целью увеличения коэффициента размножения участки семядоль от соматических змбриоидов повторно культивируют при тех же условиях, получая каллусную массу, а затем и соматические эмбриоиды, развива.- ющиеся в растения,П р и м е р 1. Зеленые коробочки с недозрелыми семенами чая сорта Грузинский К 2 подвергают поверхностной стерилизации, погружая их в 96 этиловый спирт, обжигают О пламени спиртовки. Такой прием поверхностной стерилизации позволяет получить 100%-ный выход неинфицированного материала при 100-ном сохранении его жизнеспособности, В асептических условиях удаляют с семян наружные покровы, извлекают семена и вырезают половой зародыш, каждую семядолю делят на четыре Фрагмента и эти фрагменты помешают на агаризованную среду Гамборга В 5, дополненную сахарозой 3%) витаминами; никотиновой кислотой 1 мг/л, гиамином 10 мг/л, пиридоксином 1 мг/л, мезоинозитом 100 мг/л;6-бензиламинопурином 1 - 20 мкмоль, а-нафтилуксусной кислотой 2 - 20 мкмоль, рН среды до автоклавирования доводят до 5,8 - 5,9, Условия культивирования: инкубирование эксплантатов в первые 15 сут в темноте при 25+1 С, а затем в условиях освещения при 2 - 4 лк, фотопериоде 16/8 ч. Более длительное пребывание эксплантатов в условиях темноты приводит к частичной потере эмбриогенного потенциала каллуса, а при помещении эксплантатов сразу в условия освещения полностью ингибируется развитие эмбриогенного каллуса.Дальнейшее развитие соматических эмбриоидов происходит более синхронно и за меньший промежуток времени на среде с уменьшенным вдвое содержанием регуляторов роста.Соматические змбриоиды на семядольной стадии развития помещают на 1/2 состава среды Гамборга В 5, дополненную 1 мкмоль 6-бензиламинопурина и 5 мкмоль ф-индолилмасляной кислоты. Использова 5 10 Формула изобретения Способ получения растений-регенерантов чая, включающий введение эксплантатов в культуру, культивирование на питательной среде с последующим получением регенерантов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения получечия регенерантов и повышения их выхода, в качестве зксплантатов используют семядоли из недозрелых семян, культивирование осуществляют на модифицированной среде Гамборга В 5, в которую вносят 2 ммоль 6-БАП и 10 ммоль а-НУК, при следующих режимах. первые 15 сут его проводят в темноте, далее культивирование осущесвляют на свету для индуцирования эмбриогенного каллуса, который помещают на ту же среду с уменьшенной вдвое концентрацией используемых регуляторов роста для получения соматических змбриоидов до с мядольной стадии развития, после чего их переносят на среду Гамборга ВБ с уменьшенной вдвое концентрацией минеральных солей, в которую дополнительно вводят 1 ммоль 6-БАП и 5 ммоль 3 -КМК. 15 20 25 30 35 40 45 50 ние полного состава среды Гамборга Вз приводит к опережению роста и развития побега над корнем, кроме того, корень растет в основном в длину и не формирует боковых ответвлений.Растения-регенеранты переносят в почву, укрывают в течение 15 - 20 дней полиэтиленовой пленкой, а после этого выращивают в обычных условиях.П р и м е р ы 2 и 3, Способ осуществляют аналогично примеру 1, отличие состоит в том, что действие подтверждается исследованиями на других сортах чая, а именно Колхида и Китайская крупнолистная Форма.Влияние концентрации регуляторов роста в индуктивной среде Гамборга В 5 "а характер ответа эксплантатов при п = 40) представлено в табл, 1, влияние концентрации регуляторов роста на темп развития соматических эмбриоидов до семядольной стадии - в табл. 2, влияние концентрации регуляторов роста в 1/2 состава среды Гамборга В 5 на характер Формирования проростков чайного растения из соматических эмбриоидов на семядольной стадии развития - в табл, 3,1621825 Таблица 1 Грузинский М 2 ККФКолхида Концентрация регулято ов оста, мкмоль Ответившие,Ответившие,БАП Ответившие,НУК Характер ответаСоматические эмбриоиды Сорт 6-бензиламинопуринОбщее количество, шт. Развившиеся до семядольной ста ии,а - нафтилуксусная кислотаГрузинский М 2 Колхида Крупнолистнаякитайская форма Таблица 3 0 1 2 2 4 4 5 20 0 10 20 10 20 10 20 2 10 0 2 1 4 0 2 1 4 0 2 10 60 50 100 55 35 37,5 30 65 Кн Кэ,Кн Кз,Кн, Р Кз, Кн Кэ,Кн,Р Кз, Кн Кэ, Кн Кн, ЭП Кн, ЭП