Способ выявления функционирующих капилляров

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК Г 1 ) О 661 О 5 А б 1 В 10/О ЗОБРЕТЕН АВТО РСКОУ 1 ДЕТЕЛ Ь СТ(71) Казанский государственный институт усовершенствования врачей им. В.И. Ленина(56) Долежел СВ ендеров С.М, Усовершенствованный гистологический метод выявления открытых капилляров, Бюллетень экспсриментальной биологии, 1977, М 9, с, 377-379.(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ФУНКЦИОНИРУЮЩИХ КАПИЛЛЯРОВ(57) Способ выявления функционирующих капилляров относится к области медицины, а именно к нормальной и патологической физиологии сердечно-сосудистой системы, и может быть использован для функциональной характеристики терминального звена микроциркуляторного русла в норИзобретение относится к медицине, а именно к нормальной патологической физиологии сердечно-сосудистой системы, и может быть использовано для функциональной характеристики терминального звена микроциркуляторного русла в нормальных и патологических условиях.Цель изобретения - ускорение и упрощение способа,Поставленная цель достигается тем, что процесс обезвоживания и фиксации блоков тканей осуществляют одновременно в смеси, состоящей из 40%-ного раствора формальдегида и абсолютного (100 ) этилового спирта в соотношении 1:9, при - 20 ОС в теющеи инкубаой смеси при чение оставГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР мальных и патологических условиях. Цель изобретения - ускорение и упоощение спосооа. Цель достигается тем, что процесс обезвоживания и фиксации блоков тканей ссуществляется одновременно в смеси, состоящей из 40%-ного раствора формальдегида и абсолютного (100 ) этилового спирта в соотношении 1:9, при температуре -20 С в течение первых 4 ч с последующей инкубацией блоков в двух порциях этой смеси при комнатной температуре в течение сставшихся 2 сут. Способ технически легко воспроизводим, позволяет в более короткие сроки с меньшим набором реактивов и оборудования изучить функциональное состояние внутриорганного капиллярного русла, осуществить контроль за действием различных вазоактивных препаратов на микроциркуляторную систему в условиях нормы и патологии, а также выявить локализацию и определить размеры очагов ишемии при моделировании ряда сосудистых заболеваний. чение первых 4 ч с последуцией блоков в двух порциях эткомнатной температуре в тешихся двух суток,Способ осуществляют следующим образом,Крупных лабораторных животных (например: кролик, кошка, собака) наркотизируют гексе налом (15 - 20 мг/кг, внутрибрюшинно), Извлекают исследуемый орган, край или часть которого можно выделить без нарушения его кровоснабжения (например: печень, селезенка, желудочно- кишечный тракт и т.д,). Под необходимый участок органа подкладывают кусочек фоль 1616610ги. Через 10-20 мин "отдыха" орган заливают переохлажденным пропанбутаном (в дальнейшем - пропан). Для этого открывают вентиль баллона с пропаном и позволяют ему в количестве 100-150 мл свободно вытекать в сосуд Дьюара, на дно которого предварительно кладут небольшой кусочек сухого льда. Затем пропан охлаждают, погружая его в медном стакане в жидкий азот, Проморозку органов у мелких лабораторных животных, таких как мышь, крыса, морская свинка, хомяк и т,д. (предварительно наркотизированных гексеналом в той же дозировке) осуществляют путем опускания тушки в стакан с переохлажденным пропаном. Таким же способом производится глубокое охлаждение ткани головного мозга (доступ к которой в прижизненных условиях невозможен без нарушения регионарного кровенаполнения) с последующим быстрым вскрытием черепной коробки.Затем из замороженного органа выдалбливают пластинки ткани толщиной 3 - 5 мм с помощью долота, охлажденного в сосуде с сухим льдом, Выделенный замороженный блок быстро переносят в смесь, состоящую из 40 О-ного раствора формальдегида и абсолютного (100 ) этилового спирта в соотношении 1,9, предварительно охлажденную до - 20 С в морозильной камере бытового холодильника. Срок инкубации блоков при данной температуре - 4 ч. После этого сосуд с фиксирующими блоками вынимают из холодильника, и дальнейшая инкубация ткани в формалин-этанольной смеси (ФЭС) осуществляется при комнатной температуре. Спустя 6-8 ч от начала инкубации ФЭС необходимо обновить, Полный период инкубации блоков составляет 48 ч, Необходимо помнить, что объем инкубирующей жидкости должен постоянно превышать объем . всех взятых блоков не менее чем в 20 раз.После окончания инкубации блоков в ФЭС их сразу же пропитывают парафином в условиях пониженного атмосферного давления (достаточно водоструйного насоса), Процесс парафинизации ткани длится 8 - 10 мин. Из парафинизированных блоков на обычном микротоме изготавливают срезы толщиной 20 мкм, для расправления их пе.реносят в дистиллированную воду и приклеивают на предметное стекло с помощью белка, приготовленного по Майеру. Затем препараты высушивают и депарафинизируют (ксилол, абсолютный этиловый спирт и70 О-ный этиловый спирт),После смачивания срезов дистиллированной водой проводят бензидиновую реакцию по Пикворсу. В начале препараты инкубируют в растворе М 1 в течение 5 мин, 40 вым наркозом (15 мг/кг, внутрибрюшинно)произведен срединный нижне-шейный кожный разрез. После выделения проксимального сегмента обеих подключичных артерий отыскивали устье позвоночных артерий, расположенное дистальнее места отхождения каротид. Проксимальный участок обеих позвоночных артерий брали на лигатуру и перевязывали, Кожную рану послойно ушивали наглухо,50За несколько минут до опыта приготавливали переохлажденный пропанбутан (в дальнейшем - пропэн). Для этого брали баллон с пропаном, открывали вентиль и позволяли пропану в количестве 100-150 мл свободно вытекать в сосуд Дьюара, на дно которого предварительно помещали небольшой кусочек сухого льда, Пропан охлаждали, погружая его в медном стакане в жидкий азот,5 102030 Для его приготовления берут 0,5 г бензидина-основание и растворяют в 50,0 мл 96 О-ного этилового спирта, 0,1 г нитропруссида натрия растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды. Оба раствора смешивают и доводят дистиллированной водой до 100,0 мл. Раствор нитропруссида натрия не стоек, поэтому его готовят перед употреблением. Признак порчи этого раствора - появление зеленовато-голубоватой окраскипосле прибавления раствора бензидина. В последующем среды быстро споласкивают дистиллированной водой и перекладываютв раствор М 2 на 3 мин. Для его приготовления берут 50,0 мл 96 этилового спирта, куда прибавляют 2,0 мл ледяной уксусной кислоты и 0,5 мл пергидроля, 0,1 г нитропруссида натрия растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды. Оба раствора смешивают и доводят дистиллированной водой до 100,0 мл, После окончания инкубациипрепараты споласкивают дистиллированной водой не менее 10 мин и высушивают электрическим вентилятором,Конечный этап способа состоит из последовательного обезвоживания (в 96 О-ном этиловом спирте), просветления (в ксилоле)и заключения препаратов в бальзам. Предпочтительно хранить готовые препараты в темноте, поскольку на свету они со временем выцветают.Внутрисосудистые эритроциты, обработанные с помощью бензидина, окрашиваются в черный цвет, поэтому функционально-активные капилляры хорошо контрастируют на бесцветном или слегка зеленовато-голубоватом фоне среза,П р и м е о 1, Белой беспородной крысе - самцу массой 13.,г под гексеналоЧерез 6 ч после операции наркотизированное гексеналом (в той же дозировке) животное опускалось в стакан с переохлажденным пропаном и затем быстро вскрывалась черепная коробка. С помощью микродолота, охлажденного в сосуде с сухим льдом, из замороженного головного мозга выдалбливали продолговатый мозг, варолиев мост, гипоталамус и большие полушария (задний отдел) толщиной не более 3-5 мм. Выделенный замороженный блок быстро и реносили в смесь, состоящую из 40 ф -ного раствора формальдегида и абсолютнага (100 ) этилового спирта в СООтношении 1:9, предварительно охлажденную до -20 С в морозильной камере бытового холодильника. Срок инкубации блоков при данной температуре 4 ч.Способ будет с успехом применен для . выявления функциониоующих капилляров практически в любых органах экспериментальных животных. Он позволяет, с достаточной долей информативности, не только качественно, но и количественно оценить функциональное состояние терминального отдела микроциркуляторного русла в момент остановки кровотока, т.е. в прижизненных условиях. Для количественной характеристики эритроцит-содержащих капилляров использовали окуляр-микрометр и микрометрическую сетку, встроенные в обычный световой микроскоп, Общепринятыми методами измеряли плотность и, длину 1, мкм, и диаметр д, мкм, капилляров в 1 мм препарата. Полученные показатели использовали для вычисления с 2 оедней площади поверхности М=л 1 оп, мкм /мм 3, среднего обьема Ч =д Ь, в мкм /мм,2 3 3 Лпоперечного сечения Я = б и, мкм /мм,=4капилляров-параметров, характеризующих уровень регионарного кровенаполнения и транскапиллярный обмен. Все это имеет большое диагностическое значение при изучении закономерностей внутриорганного локального кровоснабжения в условиях нормы, действия различных экстремальных (стрессовых) факторов, при моделировании ряда сосудистых заболеваний (гипертониче ская болезнь, атеросклероз, различные окклюзии, аномали, травма и т,д,), в процессе испытания вазоактивных фармакологических препаратов.Опыт выявления функционирующих капилляров предлагаемым способом показал, что необходимо постоянно контролировать качество приготовления препаратов. Для этого желательно проводить параллельную обработку гистологического материала от опытных (например 5 - 6) и контрольных (например 2 - 3) животных. Если срезы, полученные от контрольных животных, будут отличаться от тех, которые были обработаны 5 ранее(например появление экстравазатов -признака деструкции капилляров, выраженного зеленовато-голубоватого фона, отсутствие капиллярного рисунка или его недостаточное контрастирование), то мате риал, полученный от опытных животных иобработанный в тех же условиях, не анализировался и уничтожался. После этого последовательна проверялась вся цепочка этапов метода и находилась причина, спо сабствующая появлению того или иного методического артефакта (возможное неравильное приготовление и хранение реактивов, нарушение режима и сроков фиксации препаратов и т.д.), которая немедленно 20 устранялась. Затем на 2 - 3 контрольных животных проводился контроль воспроизводимости метода и если результаты не расходились с полученными ранее, то запускалась опытная серия животных (при обя эательном параллельном контроле),Необходимо отметить, что при правильном выполнении способа все причины, веду цие к методическим артефактам, как правило, беэ труда выявляются и устраняются.30 Таком образам, предлагаемый способвыявления функциснирующих капилляров технически легко воспроизводим, не требует дорогостоящей аппаратуры, уменьшает количество используемых реактивов, осу ществляется в более короткие сроки без/худшения качества выявляемых гистологических структур. Одновременно он высоко- информативный и доступный в работе экспериментальной лаборатории различ ного профиля, способствует ускорениювыполнения профильных научно-исследовательских работ.Формула изобретения Способ выявления функционирующих 45 капилляров, включающий глубокое замораживание органа, обезвоживание, фиксацию, парафинизацию блоков, резку их на микротоме, депарафинизацию срезов, окраску по Пикворсу, обезвоживание, прасвет ление и заключение в бальзам, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, процесс обезвоживания и фиксации блоков тканей осуществляют одновременно в смеси. состоящей иэ 55 40 -ного раствора формальдегида и абсолютного этилового спирта в соотношении 1:9, при температуре - 20 С в течение первых 4 ч с последующей инкубацией блоков в двух порциях этой смеси при комнатной темпаоатуре в течение последующих двух суток.