Способ идентификации рыб и их гибридов

)5 А 01 К 61/О ГОСУДАРСТВЕННЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР ИТЕТКРЫТИЯМ Е ИЗОБРЕТЕН ИС АВТОРСКО ИДЕТЕЛ ЬСТВ(56) Авторское свидетельство СССРМ 968902, кл, А 01 К 61/00, 1981.(54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ РГИБРИДОВ(57) Изобретение относится к рыб мышленности, а именно способам идентификации рыб и их гибридов. Целью изобретения является исключение гибели рыб в ельский процессе исследования и ускорение про цесса. У исследуемых рыо берут соскоб сли- .И.Ива-, зи с наружных поверхностей тела, готовятэкстракт белков и подвергают его электрофорезу в полиакриаламидном геле, содержащем 4-метилумбеллиферилацетат, при этом электрофорез и сканирование проводят од ИХ новременно, затем сопоставляют полученные электрофореграммы со стандартами. ой про табл 1 ил,едова БИ ся к рыбной проспособам, связанб и их гибридов, ого генетического и рыбозаводских е относит именно к кацией р жигненн иродных изобрыбРоНеосущ исключеования и ретения являетсяв процессе исследсса.ествляется следующим обо У исследуемых рыб и соскоб колпоидной ткани поверхностей тела в ко смешивают с равным обь харозы, Отмеряют 20 мк подвергают его эпектроф полиакриламидного ге 0,0030 флюоресцирующ тилум белл иферилацетата 400-500 В в течение 5-10 облучая электрофорезир длинноволнового ультра Выявляемые таким обра рижизненно берут (слизь) с наружных личестве 0,5 мл и емом 200-ной сап этого раствора и срезу в пластинах . ля, содержащего его субстрата 4-ме, при напряжении мин,одновременно уемый гель пучком фиолетового света.эом эпектрофореИзобретени мышленности, а ным с идентифи а также для при мониторинга пр популяций рыб,Целью ние гибели ускорение и Способграммы видоспецифичного белка эстеразы Д, присутствующей в исследуемых образцах коллоидной ткани (слизь), сравнивают с известными стандартными электрофоретическими вариантами эстеразы Д соответствующих вид рыб или их гибридов. Слизь, как ткань, используют из-за наличия в ней белка эстеразы Д, Эстераза Д проявляет видовую специфичность, Присутствие в геле 4-метилумбеллиферилацетата дает возможность одновременно выполнять две операции, которые раньше осуществлялись последовательно - электрофорез и сканирование электрофорезируемого геля в ультрафиолетовом свете.Наличие в геле фл)ооресцирующего субстрата обеспечивает образование ферментсубстратного комплекса эстераза Д 4-метилумбеллиферилацетат в самые первые минуты процесса электрофореза экстракта белков. В свою очередь, этот образовавшийся ферментсубстратный комплекс можно сделать видимым для регистрации, если наэлектрофорезируемый гель направить пучок длинноволнового ультрафиолетового света.При использовании предлагаемого способа затраты времени на проведение электрофореза и получение флгооресциругощих электрофореграмм сокращаются; вместо 40 мин по прототипу они составляют 10 минпо предлагаемому способу,П р и м е р 1. Отбирают из мест обитания ,8 видов рыб. Сведения об исследованных , рыбах приведены в табл.1,У исследуемых особей с помощью глазного скальпеля берут соскоб коллоидной ткани (слизь) с хвостового плавника. голученный образец этой ткани смешивагот с равным обьемом 20 ог-ногг сахарозы и 20 мкл этого белкового раствора вносят в лунку по лиакриламидного геля, который содержит О,ООЗО флюоресцирующего субстрата 4-метилумбеллиферилацетата. За гем в течение 10 мин на гель подают напряжение 500 В постоянного тока и одновременно облучают электрофорезируемый гел ь пучком дгги и новолнового ультрафиолетового светя, При таком сканировании в геле видны четкие флюоресцирующие электрофоретические вярианты эстеразы Д анализируемьгх видов рыб в виде дискретных полос, которые сопоставляют с известными стандартными электрсгфоетическими вариантами эстеразы Д этих видов,На чертеже предс.гавлены результаты видовой идентификации рьгб, Ка чертеже изображено:- атлантический лосось; 1 кумжа; 111 - гибриды лосссь х кумжа; Ч - минога; Ч - сингиль (кефаль); И - плотва; Ив елец; И,1 - карп.П р и м е р 2, Ка рыэоводном заводе провели ряд индивидуальных скрещиваний между лососем (Яа 1 гпо еа 1 аг 1,) и кумжей (Багпо тгопа 1.) с целью про ведения генетического анализа на эстерязе Д, Для этого у отловленных в реке производителей, находившихся в преднерестовам состояггигг, с помощью скальпеля брали соскоб коллоидной ткани (слизь) с хвостового плавника. При этом к спинному плавнику каждой оаследуемой особи прикрепляли подвесную метку, на которой указан порядковый номер, Затем его регистрировали в протоколе опыта, Взятый образец коллоидной ткани подвергали электрофоретическому анализу .и определяли видовуго принадлежность данной пронумерованной особи способом, указанным в примере 1, Полученный результат аидовой идентификации регистрировали в протоколе. Этим способом было проанализировано 8 рыб (производителей) 4 лосося и 4 кумжи. Затем осуществляли подбор родительских пар и проводили индивидуальные скрещивания по следующейсхеме: 1) лосось х лосось; 2) кумжа х кумжа;3) лосось х кумжа; 4) лосось х кумжа, Опло 5 дотворенную икру, полученную в каждомскрещивании, помещали на инкубацию в отдельные садки с тем, чтобы избежать ееслучайного смешивания. Сразу же после оплодотворения икры молоками у родитель 10 ских особей были взяты навески скелетныхмышц для осуществления видовой идентификации по прототипу. Затем сопоставлялирезультаты анализа коллоидной ткани(слизь) и скелетных мышц. этих родитель 15 ских особей.Было обнаружено, что у каждой отдельной особи электрофоретические вариантыэстеразы Д, полученные предложенным иизвестным способами, идентичны. Эти ре 20 зультаты были подтверждены также данными генетического анализа потомства,произведенного от указанных родительскихпар. После достижения потомством возрастной стадии "малек", оно было подвергнуто25 электрофоретическому анализу с целью выявления электрофореграмм зстеразы Д известным способом, Полученные у мальковэлектрофоретические варианты эстеразы Дв каждом отдельном скрещивании соответ 30 ствуют ожидаемым вариантам эстеразы Д,что находится в полном согласии с законами насггедования дискретных качественных признаков и доказывает правильностьидентификации родительских особей пред 35 лагдемым способом,Результаты анализа родительских пар иих потомства приведены в табл,2.Формула изобретенияСпособ идентификации рыб и их гибридов, включающий взятие у рыб образцов тканей, приготовггение экстракта белков из этих тканей, электрофорез экстракта белков 45 э полиакриламидном геле, инкубированиегеля в растворе 4-метилумбеллиферилацетате, получение элактрофореграмм путем сганирования геля в ультрафиолетовом свете и сопоставление последних со стандарта ми, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюисключения гибели рыб в процессе исследования и ускорения процесса, в качестве ткани для приготовления экстракта белков используют слизь, взятую путем соскоба с 55 наружной поверхности тела, а из полиакриламидного геля для злектрофореза испол ьзугот гели из полиакриламидного геля,1611303 Таблица 1 Обьем выборки Вид Место обитания И енти ика ия поспособ известном и е лагаемом Реки и озера 500 400 400 Гибридынлосось х кумжаМиногаСингиль+кефальПлотваЕлец+Ка и 400 ГибридыЛОСОСЬ Х КуМжаМиногаСингиль Гибридылосось х кумжаМиногаСингиль 462 100 РекиРекиРыбопитомник 150 50 180 ПлотваЕлецКа и ПлотваЕлецКа и,Редактор А.Ш Тираж 443 Подписноесударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 475 Заказ 378 ВНИИПроизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 1 АтлантическийЛОСОСЬАтлантическийлососьКумжа Рыбоводные заводыРыбоводные заводыРыбоводные заводыРекиМоре АтлантическийлососьАтлантическийлососьКумжа АтлантическийлососьАтлантическийлососьКумжа