Способ определения миграционной способности макрофагов и лейкоцитов

(56) Иммунологиред. Г.фримеля,с.310,Бюп. Р 36ммунол о гиин, И.В.Красильнии Е.А,Белякова8.8)ческиеМ,; Мед методы/ Под ицина 1987,СПОС (57) исполмунно ни ости посо ител следу Изоб ие от нарии, в чй иммунноию изобретентви: ельнометода опобности м вете еточ ие чув нои сносцитов,Спосо яетс дующимомогенистворе-растворенную о суще образом,Предварительно . зацию исследуемой Хенкса при соотно 100:0,25-0,20 и в роводя ткани в.р енин ткан осят полу зу ки ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬПИЯИ И ГННТ СОО ПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИГРАЦИОННОЙ НОСТИ МАКРОФАГОВ И ЛЕЙКОЦИТОВ зобретение относится к области ны и ветеринарии и может быть эовано для оценки клеточной имреэистентности, Целью изобреявляется повьппение чувствительупрощение и ускорение способа, заключатся в том, что предвано проводят забор крсви или исмой ткани, которую гомогенизиосится к медицине астности к оценкерезистентности. ия являтся повышети, упрощение и уседеления миграционакрофагов и лимфоруют в растворе Хенкса при соотноше" 1нии раствор-ткань 0,20-0,25;100 и затем вносят полученную смесь или нестабилизированную цельную кровь вмиграционную камеру, содержащую средудля культивирования клеток. Камерапредставляет собой две пластиковыеповерхности, расположенные параллель,но относительно друг друга. Поверхвнесенного в камеру образца при соотношении раствор Хенкса-образец1:0,004-0,006 располагают диск фильтровальной бумаги, инкубируют камерупри 37 С 10-12 ч и учитывают результаты путем обрисовки контуров миграции на камере с последующим перенесением их на кальку, вырезанием, взвешиванием и определеним ичдекса миграции по разнице весов в опыте и контроле. Способ позволяет повысить точность определения и упростить метосмесь или нестабилизированную цельную кровь в миграционную камеру, представляющую собой две пластиковые поверхности, параллельно расположенные одна относительно другой с размещенным между ними фильтровальным диском, при этом фильтровальный диск располагают поверх внесенного в камеру образца при соотношении раствор Хенкса-обраэец 1:0,004-0,006, инкубирование проводят 10-12 ч, а учет рельтатов осуществляют путм обрисовконтуров миграции на камре с по-, следующим перенесением площади мигра 1596252ИМ = --- " 0,7715 3 19,8 ции на кальку, вырезанием, взвешиванием н определением индекса миграциипо разнице весов в опыте и контроле.Камерой, в которой проходит реак 5ция, является чашка Петри диаметром35-40 мм.Вместо капилляра, широко используемого в беэагаровой модификации,;впервые предлагается использование 10диска фильтровальной бумаги,Приготовление гомогената исследуемого органа в минимальном количествераствора заменяет центрифугированиеобразца, предусмотренное классической 15методикой постановки реакции.П р и м е р 1, Мышей линии ВАЯВ/С,обоих полов, 12-16 г, однократно интраназально заражали вириояной фракцией РС-вируса, штамм "1,опт" (10 20,ЦПД /02 мл/гол.). Через десять днейпосле заражения получали легкие, гомогенизировали в гомогениэаторе на растворе Хенкса в соотношении на 100 мг,легочной ткани - 0,2 мл раствора. Полученный гомогенат в объеме.4 мкл наносили на диск Фильтровальной бумагидиаметром 6 мм, Пропитанный гомогенатом диск вносили в камеру, приготовленную из чашки Петри диаметром 3540 мм, с раствором Хенкса (1 мп), содержащим раствор вирионной ФракцииРС"вируса на растворе Хенкса в концентрацич 1 О мкг/мн. Камеры (по 3 сантигеном и беэ него) инкубировалипри 37 фсу 53 Со 10 ч.Учет результатов РТММ оценивапипутем просмотра в косых лучах искусственного источника света начерном Фонезоны миграции, очерчивали начашке Пет 40ри карандашом по стеклу, Очерченныйконтур миграции переносили на кальку,вырезали и взвешивали на торсионныхвесах в мг; Результаты РТММ высчитывали по формуле 45 где ИМ - индекс миграции;А - средний вес кальки в опыте 50(раствор Хенкса с антигеном);В - средний вес кальки в контроле (раствор Хенкса без анти). гена)В данном. слУчае полУчены следующие данные ф Чем меныпе индекс миграции, тем вьпне уровень клеточного иммунного ответа.Индекс миграции, равный 0,77, ука- зывает на высокий уровень специфической клеточно-опосредованной реакции при интраназальном заражении мышей вирионной фракцией в дозе 10 ЦПД / 0,2 мл/гол.П р и м е р 2. Мышей заражали ин" траназально вирионной Фракцией РС"вируса в дозе 10 ЦПД /0,2 мп/гол. Через 10 сут у мьппей брали кровь из ретробульбарного синуса глаза в объеме 5 мкл, наносили на Фильтровальный диск диаметром 6 мм и помещали в ка-: меру, содержащую 40 мкг конканавалина А (контроль не содержал антчгена). Камеры инкубировали при 37 С, 5 Х СОв течение 11 ч.Результаты учитывали путем обведения контуров миграции лейкоцитов в косых лучах искусственного источника свта На черном фоне.Обведенные контуры с чашки Петри переносили на кальку, вырезали и взвешивали на торсионных весах в миллиграмах по формуле; где ИИ - индекс миграции;А - средний вес кальки в опыте(раствор Хенкса с конканавалином А) 1В - средний вес кальки в контроле (раствор Хенкса без конканавалина А). В предлагаемом примере индекс миграции лейкоцитов составил Полученные результаты реакции торможения лейкоцитов показалч воэможность использования неспецифическихмитогенов (конканавалин А) для определения неспецифической активностиТ-системы заражения мышей,Таким образом, предлагаемый методпозволяет за сравнительно непродолжительный период времени определитьдостоверный индекс миграции макрофа-.гов и лейкоцитов,Результаты, полученные в класси"ческом варианте и в данной модификации, показали преимущество предлаЮ Составитель Р. ГуменюкТехРед М. Дидык КорректорС,Шевкун Редактор Н. Горват Заказ 2906 Тираж 511 Подписно е ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Жр Раушская набер д, 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", геужгородр ул, Гагарина, 10 5 1596252 Ьгаемого способа, заключающееся в том; культивирования, с последующим инкучто на постановит обита аатрачнваетсф,. бированиеи внесенного оправив в привсего 5 -15 мин (в прототипе 30-60 сутствии антигена и без него и учетом мнн), а в целом проведение способа .результатов по индексу миграцйир о тпредпагаежм образом занимает 10-12 ч л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью(в прототипе 22"24 часа), т.е. в 2: повышения чувствительности, упрощения раза сокращается время, затрачиваемое и ускорения способа, поверх исследуена определение миграционной способ- мого образца располагают фильтровальности клеток. 10 иую бумагу и проводят инкубирование10-12 ч, а учет результатов осуществ- Ф о р м у л а и з о б р е т е н н я ляют путем обрисовки контуров миграСпособ определения миграционной ции на камере с последующим перенесеспособности макрофагов и лейкоцитов, кием их иа кальку, вырезанием, взвевключающий обработку исследуемой тка 15 шиванием и определением индекса миг-. ни или крови, внесение их в мигра" рации по разнице масс в опыте и кон ционную камеру, сбдержащую среду дня троле.