Способ получения жизнеспособных поздних бластоцист лошадей in viтrо

) 1 1)4 С 12 Б 5/00 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ П.(НТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯИ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ бриот к льт И относится к эмно к способам уонов лошадей.ения - получение тение а име эмбр зобре ноло ованияЦель и з(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХПОЗДНИХ БЛАСТОЦИСТ ЛОНАДЕИ 1 Б Ч 1 ТВО(57) Изобретение относится к эмбриотехнологии, а точнее к способам культивирования эмбрионов лошадей, Цельюизобретения является обеспечения нормального роста и развития позднихбластоцист лошади п чьего и разработка способа оценки их жизнеспособнеспособных поздних бластоцист лошадей з.п чьего,Поставленная цель достигается тем, что эмбрионы после извлечения помещают в питательную среду, инкубируют в термостате в течение 12- 24 ч, а затем отбирают бластоцисты с поверхности питательной среды, содержащей желток куриного яйца и фосфатно-солевый буфер Дюльбекко и/или кобылье молоко при следующем соотношении компонентов: желток куриного яйца: фосфатно-солевый буфер Дюльбекко (1-3):(2-4); желток куриного яйца: кобылье молоко (1-4):(1-4)ф, желток куриного яйца. фосфатно-солевый буфер Дюльбекко: кобылье молоко (1-3):(1-3):(1-3). ности. Для этого бластоцисты послеизвлечения и оценки помещают на 1224 ч в культуральную среду, содержащую желток диетического куриного яйца,фосфатно-солевой буферный раствор Дюльбекко (ФБС Дюльбекко) и/или стерилизованное кобыльемолоко,и культивируют вобычной газовой атмосфере. При остальных равных условиях, наилучший результат получается при культивированиибластоцист в среде, содержащей,мас.Х; желток 40, ФБС Дюльбекко 20,молоко 40. Жизнеспособность эмбрионов определяют визуально по местуих расположения в толще жидкости.3 з.п. ф-лы, 3 табл. Для определения оптимальных соотношений вводимых в среду компонентов используют принцип треугольной трех- компонентной диаграммы Гиббса-Розебома. В одной серии опытов готовят 2 вариант среды с 207-ным интервалом концентрации базового раствора, желтка и молока. Всего проводят 2 серии опытов, В первой серии опытов зародыши культивируют в течение 12 ч, а во второй в течение 24 ч,Способ осуществляют следующим об. В стерильный флакон последовательно добавляют желток куриного яйца, ФБС Дюльбекко и/или кобылье молоко в указанных соотношениях.Компоненты осторожно перемешивают, не допуская образования пены, до получения однородной смеси. Флакон со средой помещают в термостат для подогрева до оптимальной температу50 3 149721ры. Извлеченный 8-дневный эмбрионлошади пипеткой переносят в культуральную среду и инкубируют при 37 С,До и после культивирования проводятоценку и измерение эмбрионов под микроскопом 11 СБ,Интенсивность роста бластоцист всреде, состоящей из желтка куриногояйца и ФБС Дюльбекко в соотношениях 10(1-3);(2-4), приведены в табл. 1.Наилучший результат получен прикультивировании в среде 3 (6 млжелтка и 4 мл ФЭБ Дюльбекко),Интенсивность роста бластоцист в 15среде, состоящей из желтка куриногояйца и кобыльего молока в соотношениях (1-4):(1-4), приведено в табл. 2.Стабильный рост бластоцист наблюдают в среде 8, содержащей 4 млжелтка куриного яйца и 6 мл стерильного кобыльего молока.Интенсивность роста бластоцистВ среде содержащей желток куриногояйца, ФБС Дюльбекко и кобылье молоков соотношениях 1:3):(1:3):(1:3)и приведена в табл. 3,Анализ результатов культивированияпоказывает, что бластоцисты развиваются какйри 12-часовом, так ипри 24-часо-вом культивировании, причем рост является стабильным. Наилучшие результатыполучают при культивировании эмбрионов в среде 14, которая содержит4 мл желтка куриного яйца 2 мл ФБСДюльбекко и 4 мл стерилизованногокобыльего молока.Таким образом, устанавливают, чтовосьмисуточные лощадиные эмбрионы впериод 12-24 часового пребывания в 40культуральных средах, состоящих изсмеси желтка с кобыльим молокоми/или. Фосфатно-солевым буферным раствором Дюльбекко, продолжают интенсивно увеличиваться в размерах, 11 ри 45просмотре под микроскопом у большинства прокультивированных в этих средах зародышей не отмечают каких-либоотклонений от нормы. Клетки трофобласта и эмбриобласта четко выражены, зародыш полупрозрачен, правильной шаровидной Формы. Эмбрионы, помещенные на 12-24 ч в чистый желтокили фосфатно-солевый буферный раствор Дюльбекко, не растут. При осмотре под микроскопом у них обнаруживают признаки дегенерации: клетки трофобласта сморщиваются и сжимаютсяв плотный помутневший комок, оболоч 5 4ка-бластолемма резко отделяется отклеточной массы по всему периметру,Часть помещенных в чистое кобылье молоко либо смесь кобыльего молока сфосфатно-солевым буферным растворомДюльбекко эмбрионов увеличиваетсяв размерах незначительно. Эти зародыши, как правило, сохраняют нормальную клеточную структуру, полупрозрачны, но у них по периметру просматриваются участки с частично отделенной от клеточной массы оболочкой-бластолеммой.Во время проведения опытов неожиданно обнаружено, чем эмбрионы снормальной клеточной структурой,помещенные в среды 2-4, 7-9, 11-16,всплывают к поверхности жидкости иприближаются к стенкам стеклянногососуда, где могут быть легко обнаружены визуально. Эмбрионы с нарушенной клеточной структурой постепеннопогружаются в толщу жидкости. Крометого, плавающие у поверхности бластоцисты за период культивированиясущественно увеличиваются в размерах. Опустившиеся в толщу жидкостизародыши не растут.Клеточная структура плавающихпосле культивирования у поверхностизародышей не отличается от нормы.Опустившиеся в толщу эмбрионы всегдаимеют сморщенные и спавшие клеткитрофо- и эмбриобласта и отслоеннуюоболочку бластолемму,Формула изобретения 1. Способ получения жизнеспособных поздних бластоцист лошадейп ч 1 го, включающий извлечениеэмбрионов, помещение их в питательную среду, содержащую желток куриного яйца и фосфатно-солевой буфер Дюльбекко и/или кобылье молоко, споследующей инкубацией в термостатев течение 12-24 ч и отбором бластоцист с поверхности питательной среды,2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что желток куриного яйца и фосфатно-солевой буфер Дюльбекко берут в соотношении 1-3): :(2-4). 3. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что желток куриного яйца и кобылье молоко берут в соотношении (1:4) в (1 е 4).1497256бекко и кобылье молоко берут в соотношении (1-3):(1-3):(1-3). 4. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что желток куриного яйца, фосфатно-солевой буфер ДюльТаблица 1 Соотношение ингредиентовв среде, мл Увеличение объема бластоцист, Е к начальному объему Среда при 24-часовомкультивировании при 12-часовом культивировании Желток ФБС Дюльбекко 610,41005,0324,3 Таблица 2 Увеличение объема бластоцист,Х к начальному объему Соотношение ингредиентов в среде, мл Среда при 12-часовом при 24-часовомкультивировании культивировании Молоко Желток 368,1 773,9 232,8 Таблица 3 Увеличение объема бластоцист,7. к начальному объему Соотношение ингредиентов в среде, млСреда ри 24-часовомультивировании ри 12-часовом ультивировании Молоко елто 2 Составитель И,ТарееваТехред М.Ходанич орректор С.Черни едактор Н.Киштулине Заказ 4406/ ВНИИПИ Госуд Тираж 501 Подписноественного комитета по изобретениям и открытиям при 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 0 2 6 4 8 О 2 4 6 10 10 8 4 6 2 10 8 Ь 4 0 336, 7 425,9 305,7 429,9 176,1 340,4304,9 490,9 398,9 275,0 125,8 413,9 133,2116, 7 442,2 709,7 62 Ь,7 844,5 864,2 767,8