Способ получения гаплоидного каллуса исчезающих видов кедра

(еЯОив А 1 12 И 5/00 ОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ТВУ 2(71) Государственный Ниботанический садитский иях по экспериментальлесной генетике. Целется увеличение кСпособ состоит в и ю едова логии в ис эмбр изоб онная,цов етения явля бразования. л(56) Ехрегыиепса 1 ешЬг сц 1 аг р 1 апгз. Ей.сей Ъ Ярг 1 пЕег. - чег 1 ая Вег ЬегЕ-Нею Тово, 1982, р 1 о 8 у оЙВ М. Лои-НеЫе37-41. ноголериом что для уют аномал ые содержа собранйых Способобразом,С дереванскогола цветен елующи ествляетс кого лифазу начадра (атласайского) врают пыльцпрепаратыметофита,в к гималя соб готазки ят постоянные ашенные ития ми К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕ 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГАПЛОИДНОГОКАЛЛУСА ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ КЕДРА 7) Изобретение относится к биотехИзобретение относится к биотелогии и может быть использованолекции лесных пород для ускореннполучения константных форм, в исдованиях по экспериментальной эмлогии и лесной генетике,Цель изобретения - увеличениелусообразования,Способ состоит в тодукции каллуса испольэпыльцевые зерна, которпыльце микростробилов,фазе начала цветения,ологии и может быть использовано селекции лесных пород для ускореного получения константных форм,т м, что для индукции каллуса используют аномальные пыльцевые зерна,содержащиеся в пыльце микростробилов,собранных в фазе начала цветения.Получен гаплоидный каллус, пригодныйдля дальнейшей работы по регенерациирастений, у кедра атласского, кедра .ливанского, кедра гималайского напитательных средах Мурасиге-Скуга, сНича, Уайта. 1 табл. С: метиловым зеленым пиронином, Препараты анализируют под микроскопом и отбирают деревья, в пыльце которых содержится 2- 43 аномальных пыльцевых фф зерен. вЬПыльцу из микростробилов собирают Я в фазу начала цветения, поскольку микростробилы, собранные в более ранние сроки, не раскрываются при помещении их в пробирку, а собранные позже не содержат необходимых для индукции каллуса аномальных пыльцевых зерен.Как показал цитоэмбриологический анализ, в микростробилах кедра, используемых в предлагаемом способе, содержится следующая смесь пыльцевых зерен: 1) оптически пустые пыльцевые зерна, 2) микроспоры, 3) фертильные пыльцевые зерна, 4) пыльцевые зерна с ускоренным развитием мужского гаме 3 149721тофита, 5) пыльцевые зерна с замедленным развитием мужского гаметофита,6) жизнеспособные пыльцевые зернанегаметофитного пути развития, 7)жизнеспособные пыльцевые зерна, 8)5.пыльцевые зерна с тремя-четырьмя воздушными мешками и гигантские пыльцевые зерна.В результате исследований установлено, что именно клеточные структуры5-8, которые можно объединить подобщим названием аномальные пыльцевыезерна, дают начало формированию гаплоидного каллуса 1 п чего. Максимально возможное число таких структурв пыльце кедров без дополнительнойиндукции составляет 47 Если в пыльце содержится менее 2 Е этих клеточныхструктур (аномальных пыпьцевых. зерен),2 Ото формирование каллуса подавляетсяпыльцевыми зернами, которые образуютпыльцевые трубки, формируют базальностебельковый комплекс и гаметы.Закрытые микростробилы стерилизуют и после помещения аномальных пыльцевых зерен на питательную средуполучают гаплоидный каллус.П р и м е р 1. Приготовление препаратов-мазков включает фиксацию иобезвоживание объекта, насьшение егорастворителями бальзама, приклеивание белком, окрашивание и заключениев бальзам, Для фиксации используютфиксатор Карнуа, состоящий из 6 чабсолютного (100 Х) или 967.-ного эта 35нала, 3 ч. хлороформа и 1 ч ледянойуксусной кислоты, Затем готовят белок для наклеивания объекта. Зрелуюпыльцу или содержимое пыльника фикси 40руют непосредственно на предметномстекле, делают мазок диаметром неболее 2 см, подсушивают, промывают703-ным этанолом и снова подсушивают,затем приклеивают белком и окрашиваютпирониномметиловым зеленым. Времяокрашивания у кедра составляет 18 ч.После окрашивания проводят дифференциацию в 963-ном этаноле в течение12 мин, Затем препараты обезвоживаютв бутаноле первом и втором (в общей 50сложности 1 ч), просветляют в ксилоле первом и втором (не менее 2 ч)и заключают в бальзам,Анализ. препаратов проводят прималом увеличении. Просмотр и излучение препаратов осуществляется подиагоналям, проведенным мысленно чеГ реэ покровное стекло, не менее чем в десяти полях зрения с тем, чтобы было учтено не менее тысячи пыльцевых зерен каждого варианта. Учитывают все типы аномального морфогенеза мужского гаметофита.С отобранных таким образом деревьев кедра атласского, содержащих 2-4 Х аномальных пыльцевых зерен, собирают в фазу начала цветения цельные закрытые микростробилы, которые дезинфицируют обжиганием, оборачивают стерильной фильтровальной бумагой так, чтобы микростробилы, не проваливаясь, с трудом входили в пробирку, Подготовленные таким образом микростробилы вводят в пробирки, на 1/3 наполненные питательной средой Мура- сиге-Скуга, Пробирки закрывают стерильными ватно-марлевыми пробкамиЧерез 27-34 сут, в зависимости от оводненности диплоидных тканей микростробила, в каждой из пробирок формируется гаплоидный каллус, пригодный для дальнейшей работы по регенерации растений.П р и м е р 2. Все приемы аналогичны приемам примера 1, только исследуется кедр ливанский и использу-, ется питательная среда Нича.П р и м е р 3. Осуществляется аналогично примерам 1 и 2, только исследуется кедр гималайский и используется питательная среда Уайта.Кроме данных примеров, аналогично аномальные пыпьцевые зерна всех трех исследуемых видов кедра высаживали на все указанные выше питательные среды,Результаты опытов сведены в таблицу.Формула изобретенияСпособ получения гаплоидного каллуса исчезающих видов кедра, включающий культивирование на искусственной питательной среде выделенных микроспор и микрогаметофитов, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения каллусообраэования, для индукции каллуса используют аномальные пыльцевые зерна, находящиеся в пыльце микростробилов, собранных,в фазе начали цветения, при содержании их в микростробилах 2-4 .1497212 Выход каллуса мг сырого веса на 10 пробирок по. вариантам опыта при культивировании на различных питательных средах Вид кедра среда Мура- среда Нича среда Уайтасиге-Скуга Составитель В.ДемкинТехред М,Ходанич Корректор О,Ципле Редактор Н.Киштулинец Заказ 4406/29 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственн-издательский комбинат "Патент", г.)жгород, ул. Гагарина, 101 АтласскийЛиванскийГималайский 40 30 40 30 20 60 30 50 40