Способ определения человеческого гемоглобина в фекалиях

АТЕНТ ер(ш) е К,о 3.са 1 шегг ацхдец помещают еющий бумаж (бумажный к оболочится между фазном ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГННТ СССР"Епгушасе 1 пппцпо 1 одГог аале Йеегш 1 паг 1 оп оапй ацс 1 Ьос 11 ея. Изобретение относится к медицине, точнее к биохимическим методам обнаружения скрытой крови при диагностике различных клинически трудно диагностируемых кишечных заболеваний,таких как новообразования толстой и прямой кишки, аденомы, язвы и дивертикулы.Цель изобретения - повышение специфичности и чувствительности определения.Способ основывается на двух анализе скрытой крови, соединяющий высокочувствительный анализ с использованием гваяковой смолы с высокоспецифическим и чувствительным иммунохимическим анализом, с помощью которого определяется только человеческий гемоглобин, Эта комбинация анали(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ГЕЫОГЛОБИНА В ФЕКАЛИЯХ(57) Изобретение относится к медицине, точнее к биохимическим методамобнаружения скрытой крови в фекалиях.Целью способа является повышение специфичности и чувствительнос 1 ги способа. Гемоглобин человека выделяютиз пробы с помощью иммунохимическойреакции, т,е, реакции между антителом и антигеном, при использованиизакрепленного в твердой фазе специфического антитела гемоглобина человека. Затем определяют с помощьюферментативной реакции наличие гемоглобина, соединившегося с антителом. ов устраняет ложные положительные езультаты анализа, а такженеобходиость в контроле за пищевым режимом.Необходимое для предлагаемого спооба оборудование включает пакет для анализа кала, в которыипробу, и второй пакет, имный фильтр, Абсорбентфильтр) прикрепляетсяке пакета так, что находпропитанной гваяковой смолой, бумагой пакета и пластмассовой крышкойКогда гемоглобин экстрагируют из абсорбента, получают раствор, содержащий гемоглобин (Нв) и другие р створимые молекулы из кала, этот раствор переносят пипеткой в кювету из набора полистироловых кюветок на3 1496643стенкЬ и на дно которой нанесено определенное количество антитела человеческого гемоглобина, Здесь гемоглобин пробы (антиген) связывается с антигемоглобином твердой фазы(18 С). После инкубационного периода,равного. времени протекания иммунологической реакции, кюветку промывают водой для удаления всех несвязанных веществ.Твердая фаза может представлятьсобой полимер, отличный от полистирола, и иметь иную форму, отличнуюот кюветы или сосуда, например шарика, кольца, диска.После того как кюветка промыта,в нее помещают определенное количество 1 дС антитела человеческого гемоглобина, при этом 1 РС имеет какойлибо фермент в качестве индикатора.Связывание помеченного" ферментом1 яС с антителом в твердой фазе зависит от количества "свободных антител" в твердой фазе, оставшихся после обработки пробы. Так, с помощьюфермента можно проверить, была лиреакция между антителом (анти-НЪчеловека) с антигеном (человеческимНЪ) путем добавления субстрата, спе-.цифичного для данного фермента, приэтом фермент выделяет из субстратаокрашенное видимое или фотометрически регистрируемое соединение, Количество фермента можно определить либо измеряя количество, соединившеесяс твердой фазой, либо количество, оставшееся в растворе свободным.Анализ РЕСА-Е 1 А позволяет обнаружить только интактный гемоглобин человека, а анализ на основе гваяковойсмолы также обнаруживает продуктыраспада гемоглобина, Кроме того,устраняются ошибки, вызванные присутствием гемоглобинов животных, присущие известным способам.П р и м е р. С лабораторной стороны крышки корпуса пакета берут абсорбент, содержащий пробу, и помещают вкюветку анализатора РР. Полистироловая кюветка РРпредварительно"сенсибилизирована" с помощью иммуноглобулиновой фракции антигемоглобина.200 мкл буферного раствора, содержашего фосфат (О, 1 М полибутадиенстиро; 55ла, рН,7;4), добавляют в кюветку.Инкубация, например, 2 ч при +37 С.Кюветку промывают 400 мкл дистиллированной воды В кюветку добавляют 4200 мкл иммуноглобулиновой фракции антигемоглобина человека (полибутадиенстирол в качестве растворителя) с подходящим ферментом, например щелочной фосфатазой (добавка конъюгата). Инкубация, например, в течение 2 ч при 37 С. Промывка аналогичона, Добавляется субстрат, специфичный для фермента, который используется в конъюгате (паранитрофенилфосо фат), После 30 мин инкубации при +37 С добавляется 200 мкл 0,1 М ИаОН для остановки реакции. Результат оценивается фотометрически,Рекомендуемым пределом прекращения реакции является среднее значение абсорбции (минус контрольное значение), нормальных некровоточащих проб +3 стандартных отклонений или при отсутствии таких данных - 9200 единиц.Наименьшие количества, обнаруженные посредством этого анализа, составляют 0,05-0,1 мкг цианметгемоглобина (мл 1-5 мкл гемолизированной крови на 1 г фекалий), 140-700 мкг гемоглобина (г фекалий) и от 2,0 до 5,0 мкл цельной крови (г фекалий (280-700 мкг гемоглобина (г фекалий).формула изобретенияСпособ определения человеческого гемоглобина в фекалиях путем иммунохимического анализа, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повьппения специфичности и чувствительности способа,1 г образца адсорбируют через бумагу, пропитанную гваяковой смолой на фильтровальную бумагу, фильтровальную бумагу помещают в измерительную ячейку кюветы, предварительно обработанную в течение 15 ч при 4 С иммуноглобулиновой фракцией человеческого антигемоглобина, добавляют 200 мкл раствора фосфатного буфера рН 7,4, содержащего 0,1 М полибутадиенстирола,инкубируют 2 ч при 37 С, промывают ячейку 400 мкл дисотиллированной воды, вносят 200 мкл раствора иммуноглобулиновой фракции человеческого антигемоглобина, соединенного с щелЬчной фосфатазой и растворенного в растворе фосфатного буФера, инкубируют 2 ч при 37 С, повторно промывают, добавляют 200 мкл паранитрофенилфосфата и после инку 51496 Ь 43 6бирования в течение 30 мин при 37 фС при 405 нм определяют. общий уровеньРеакцию прекращают с помощью 200 мкл содержания человеческого гемогло,91 М раствора МаОН и по поглощению бина в образце.1Составитель Л.КонюховаРедактор М.Бланар Техред Л.Олийнык Корректор М.МаксимишинецЗаказ 4290/59 Тираз 789 ПодписноеВЯИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5