Способ обнаружения о-антигенов грамотрицательных бактерий в биологическом материале

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 199 19) 111) 1 М 33/4 ОПИСА ОБРЕТЕН ТВУ ледовательгии и инЛ,В.Громав, М.И.Гру Нагорная-П нридска(54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ(57) Изобретение оне, а именно к метдиагностики инфекцний, вызываемых грми бактериями (брюмонеллезь), дизентелью изобретения явчувствительности с НИЯ 0-АНТИГЕНОАКТЕРИЙ В БИОЛО носится к медицидике экспрессонных заболева- амоотрицательныной тиф, сальия и др.). Цеяется повышение особа за счет тинацкой.б нг/обход лоном Б и щемедици- пресс- болеваельнымиальмонелтель ки э н нт исГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ П 1 НТ СССР АВТОРСНОМУ СВИДЕ(71) Киевский научно-исский институт эпидемиолфекционных болезней им.шевского(72) А.Ф оС,Л.Ягуди И,И.Но с Изобретение относится к не, а именно к методике экс диагностики инфекционных за ний, вызываемых грамотрицат бактериями (брюшной тиф, с лезы, дизентерия и др.).Цель - повышение чувстви сти способа за счет обработ роцитов протеолитическими ф ми и формалином, и обработк обработки эритроцитов протеолитическими ферментами и формалином и обработки исследуемого образца трилоном Б и щелочью при 50-60 С. Для этого берут пробу мочи, центрифугируют ее для освобождения от взвешенных частиц, добавляют раствор динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилона Б), встряхивают, освобождают от низкомолекулярных соединений гель-хроматографией на гелях, разделяющих молекулы с молекулярной массой не более 30000 дальтон, фракцию, объем выхода которой равен внешнему объему геля, обрабатывают щелочью при 50-60 , ней Я трализуют щелочь адсорбируют О-анЭ тиген при 50-55 С на эритроцитах, предварительно обработанных протеолитическим ферментом, а затем фор- С малином, выявляют адсорбировавшие О-антиген эритроциты с помощью агглюии их специфической антисыворот" Способ высокочувствителен (3 - мл). Для получения ответа неимо затратить не более 2,5 ч. следуемого образца трилочью при 50-60 С,П р и м е р 1. Обработка эритрофитов. Баранью кровь взяли в равный объем раствора Олсвера. Эритроциты трижды отмыли от сыворотки0,15 М раствором ИаС 1 и разделилиа две части, Одну суспендировалиов нагретом до 37 С растворе Хенксас рН 7,6, содержащем 0,27 трипсина, 3 146 а другую также в нагретом до 37 С растворе Хенкса с рН 7,0, содержащем 0,27 папаина. Обе пробы при постоянном помешивании пройнкубировали в . течение часа при 37 С, охладили в смеси льда и воды. Трижды отмыли на холоду охлажденным 0,15 М раствором МаС 1. Затем эритроциты суспендировали в 0,15 М растворе МаС 1, содержащем 1,5 Е формальдегида и проинкубировали при постоянном перемешивании 18 ч при 37 С. После этого эритроциты 5 раз отмыли в 0,15 М растворе ИаС 1 и суспендировали в этом же растворе с добавлением консерванта азида натрия в концентрации 1;1000). Приготовленные таким образом эритроциты хранились в холодильнике 6 мес, не тРЯЯ способности адсорбировать О-антигены. Часть эритроцитов обработали Формальдегидом, как это описано выше, без предшествующей обработки протеолитическим Ферментом.Взяли исходный раствор О-антигена брюшнотифозной палочки (концентрация 100000 нг/мл), полученного по методу Буавена и обработанного щелочью, иприготовили 4 ряда двухкратных разведений (в объеме 0,5 мл) в смеси, состоящей из равных объемов 0,15 М раствора ИаС 1 и 0,15 М фосфатного буфера рН 7, 2, содержащей О, 27 желатина. Затем во все лунки добавили по О, 1 мл 1 Е бараньих эритроцитов. В первый ряд добавили эритроциты, обработанные трипсином и формалином, во второй - обработанные папа- ином и Формалином, в третий - только формалином, в четвертый - нативные эритроциты.о Планшеты с реакционной смесью проинкубировали в течение часа при 55 С, тщательно встряхнув после перового и второго получаса инкубирования. Затем по 0,02 мл суспензии из каждой лунки поместили в лунки П-планшет микротитратора Такачи, в которые предварительно было разлид по 0,02 мл сыворотки против брюшнотифозной палочки, Из сыворотки 1 были адсорбированы антитела против бараньих эритроцитов, Планшеты с реакционной смесью проинкубировали в течение 15 мин при 37 С, а затем их отцентрифугировали при 175в течение 5 мин и произвели учет реакции.Чувствительность способа при применении эритроцитов, обработанных трипсином и формалином, составила3 нг/мл, папаином и формалином3 нг/мл, одним формалином 50 нг/мл,5при применении нативных эритроцитов - 25 нг/мл.Таким образом, применение для определения О-антигенов эритроцитов,обработанных последовательно проте 10 олитическим ферментом и формалином,повьппает чувствительность способа-тго сравнению с прототипом, согласнокоторому для определения О-антигеновприменяются нативные эритроциты,15 в 8 раз. Обработка эритроцитов трипсином и папаином в одинаковой степени повьппает чувствительность способа.Применение эритроцитов, последовательно обработанных протеолитическим20 Ферментом и Формалином, обеспечиваетболее высокую чувствительность способа по сравнению с применением эритроцитов, обработанных лишь однимФормалином,25 П р и м е р 2. К 8,5 мл мочидобавили 0,5 мл 0,15 М раствора ИаС 1,содержащего 1000 нг О-антигена брюшнотифозной палочки. Перемешали. Отцентрифугировали при 2000 д в тече 0 ние 5 мин. Надосадочную жидкостьотсосали и к ней добавили 1 мл 25 мМраствора динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилонаБ) с рН 8,5, так, что конечная концентрация трилона Б составила 2,5 мМ.35 аПробу нагрели до 37 С и встряхивалив течение.5 мин при 37 С. По 1,5 млреакционной смеси наслоили на 5 пор"ций по 12 мл геля сефадекс 6-50, помещенных во вкладыши с сетчатым дном,на которое была уложена фильтровальная бумага. Вкладыши были вставленыв центрифужные пробирки, Для удаления дистиллированной воды, находившейся между гранулами геля, передопытом сефадекс отцентрифугировалипри 175 я в течение 20 мин. После нанесения исследуемых порций мочи пробирки с сефадексом вновь отцентрифуЬОгировали в течение 15 мин при 175Собравшуюся на дне центрифужных пробирок жидкость, содержащую О-антиген, отобрали в мерные пробирки и добавили 2,5 н раствор МаОН до конечнойконцентрации 0,25 н, Пробы прогрелипри разных режимах: первую пробусогласно прототипу прогрели в кипя- щей водяной бане в течение 6 мин,остальные пробы прогрели в течение1462199 Формула изобретения Составитель Л.СабуроваТехред М,Дидык Редактор Н, Горват Корректор В.Гирняк Заказ 668/42 Тираж 788 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 6 мин при следующих температурах; вторую - при 65 С, третью - при 60 С, четвертую - при 50 С, пятую - при 45 С. Пробы охладили, нейтрализовали соляной кислотой, используя в качестве индикатора водный раствор бромтимолового синего. Сделали двух- кратные разведения (в объеме 0,5 мл) каждой пробы в смеси, состоящей из равных объемов 0,15 М раствора МаС 1 и 0,15 М фосфатного буфера рН 7,2 и содержащей 0,2 желатина. Затем во все лунки добавили по 0,1 мл 1 бараньих эритроцитов, обработанных трипсином и формалином (пример 1). Дальнейшая постановка реакции пассивной гемагглютинации проводилась, как это описано в примере 1.Для определения количества выявленного О-антигена растворили полученный по методу Буавена и обработанный щелочью антиген брюшнотифозной палочки (концентрация 200 йг/мл) и сделали двухкратные разведения, Добавили эритроциты, обработанные трипсином и Формалином и поставили реакцию пассивной гемагглютинации (пример 1).По данным результатов реакции пассивной гемагглютинации в первой пробе было выявлена 3 нг О-анти- гена, во второй 25 нг, в третьей 100 нг, в четвертой 100 нг, в пятой 50 нг, .Таким образом, прогревание 0-антигенов в 0,25 н растворе щелочи в течение 6 мин при температурах 50 -60 С обеспечивает максимальную чувствительность способа определенияО-антигенов, В этом случае чувствительность возрастает в 32 раза посравнению с прототипом, согласно которому пробу прогревают на кипящейводяной бане.10 Прогревание О-антигенов в 0,25 норастворе щелочи при 50-60 С обеспечивает также более высокую чувствительность по сравнению с прогреованием при более высокой (65 С) ио15 более низкой (45 С) температуре. Способ обнаружения 0-антигенов 20 грамотрицательных бактерий в биологическом материале, включающий взятие пробы биологического материала,обработку щелочью, нейтрализациющелочи,адсорбцию О-антигена на эрит роцитах, выявление адсорбированныхантиген эритроцитов с помощью иммунной сыворотки, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышениячувствительности способа, к пробе 30 мочи добавляют 2,0-3,0 мМ трилона Б,встряхивают, подвергают пробу гель-фильтрации, обработку щелочью проводят при 50-60 С, а 0-антиген адсорбируют при 50-55 С на эритроцитах,предварительно обработанных трипсином или папаином с активностью 3,516 ед/мп и формалином.