Способ определения гаптенов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 385, С 01 Х 33/5; 5 4 А 6 1 ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ 5-1 ОПИСАНИЕ ИЗ ВТОРСКО(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НОВ(57) Изобретение относится к Цель изобретения - упрощение сокращение времени определения. куба ции исследуемого образца, гаптена, антисыворотки и суспенз стафилококка аигецв проводят це роьание. Промывают осадки, поме бирки с осадками в гамма-счетчи ряют количество импульсов. Спо ляет определить стельность коро центрации прогестерона в молоке АГ 1 ТГ 37рганической химии Петрашищин с 1, 1981,1.аз. Си, .(71) Институт бАН БССР,ЯО 142 ЕНИЯ:Щ; биохимии. способа и После инмеченого ии клеток нтрифугишают прок и измеоб позвов по конфорлу,а изобретения Изобретение относится к медицинской биохимии, а именно к способу определения гаптецов, ц может быть использоваго при диагностике различных патологических и физиологических состояний организма человека и животных, а также в научных исследованиях и биотехнологических процессах (цапример, получение стероидов с помощью фермецтативцых реакторов) при определении микроколичеств биологически активных вецесв в жидкостях, не содержащих значительцьх количеств иммуноглобулинов группы 6.(е,ь изобретения - упрощение определения гдпецд и сокращение времени анализа.При.ер 1. Определение количества 51 ацгсцз, необходимого для выполнения радиоигр унхоги 1 еского анализа про ессроц. Все определения дублируются.,Доб всяот в пробирки растворы реагец ов".бхфер Л (0,15 М С,х,Ч;-),ГГЛ, 50 мМ фосфд иый буфс р, ),02, Х. . р7,4) 0,1: мл;,1-прогссг гц .цу,евой с ацдарт (у(ц р А ц, ц цс содержапсе црогестероцд ксрнье мо,ко, разведенное дцстиллировдццоц водой в сооцоценци 1:5) 0,1 мл; ди цсывороткд кролц кс яроги к(ньюгст ц ро сс Ге)о ц оыч ц ц спорото цьй альбумицВСА) в разве.с - цци, еобхО,хОх д,я св 5 Зывс ния 40 Ь)",ц вцсцмого ,1-прогестероцд, О, мл;суспсгзия клеток . ацгепв и буфере В (О Зог ТВИН, 0,4, холдт, О, 5 М .хС,мМ ЭДТА, 50 мМ фосфатцый буфер, 0,02",4 Ма Х 1, р Н 7,4), содержа цд я 0,001;0,005; 0,01; 0,005; 0,5; 0,75; 1 илц 5 мг бактериальцых клеток в О, мл, 0,1 мл,В пробирки для определения цссцецифического связывания вместо дцтис 1 воротки добавляют буфер А.Содержимое всех пробирок тщательно перемешивают, и пробирки инкубцруют 4 ч при комнатной температуре. После инкубации пробирки центрифугируют 15 мин 2000 р, промывают осадки один раз 0,5 ыл буфера В. Все пробирки с осадками помещают в гамма сетчик и измеряют количество импульсов в каждой пробирке в течение 1 мин. Рассчитывают среднее арифметическое значение (х) количества импульсов для каждой пары пробирок.Определяют величину В/Т 100 О 4 для каждой дозы иммуносорбента, где В - связанная радиоактивность, имп/мин; Т - общая радиоактивность, имп/мин.В линейных координатах строят график зависимости В/Т 1 ООЯ от количества добавленных клеток Я. ацгецз. По этому графику определяют количество клеток Я. ацгецз, достаточное для полного отделения связанного антителами и свободного гаптена (0,5 мл). Присутствие в среде инкубации молока не влияет на эффективность отде 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 леция комплекса гаптена - антитело от свободного гаптена.Пример 2. Определение времени инкубации, необходимого для выполнения анализа. Все определения дублируются.Добавляют в пробирки растворы реагентов, как в примере 1, но добавляют во все пробирки по 0,1 мл суспензии с концентрацией 0,5 мг клеток (0,1 мл), а в качестве нулевого стандарта используют коровье молоко, разбавленное дистиллированной водой в соотношении 1:5. Содержимое пробирок тцательно перемешивают и пробирки инкубируют 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4;4,5; 5 ч при комнатной температуре, после чего обрабатывают, как в примере 1.В линейных координатах строят график зависимости В/Т 1 ООЯ от времени инкубации. Равновесие в системе наступает через 4 ч.Пример 3. Построение стандартной кривой. Все определения дублируются.В пробирки добавляот растворы рсасцтов, как в примере 2, цо добавляют не только нулевой стандарт, а и растворы стандартов прогестерона, содержащие 1,6; 6,3;12 3; 25; 50 нг прогестерона в мл. 1 осле ицкубдции в течение 4 ч пробирки обрабатывают, кдк в примерах 1 и 2. Определяот величину В/В 100 Я для каждого стдцдрт, где В связаццая радиоак. цвцоть в пробирках, содержащих стандартные количества прогестерона, имп/миц; Вц - связанная радиоактивность в пробирках, содексГццх цу,евой стоцддрт, цмп/ин.В линейных коооди натах строят стандартную кривуо, откладывая по оси координат значение В/В, 100 Я, а по оси абцисс - концентрацию стандартов прогестерона в нг/мл.В отличие от известного предлагаемый способ позволяет избежать предварительной длительной инкубации бактерий с дцтисывороткой и тем самым сократить время анализа на 1 сут. Поскольку реакция с днтнтелом достигает равновесия, нет необходимости вводить стадию остановки реакции. Одцостадийность процедуры анализа уменьцгает вероятность ошибки оператора.Предлагаемый способ позволяет определять концентрацию гаптенов в буферных растворах (например, в сыворотке крови после экстракции или при синтезе стероидов в ферментативных реакторах) и в молоке (например, при определении концентрации прогестерона в молоке с целью определения стельности у коров). Способ определения гаптенов, включающий инкубирование исследуемого образца, меченого гаптена и специфических антител с разделением свободного и связанного гаптена с помощью клеток Яарйуососсцз ацгецз,1428384 Составители Г. КрюковаРедактор Н. Яцола Техред И. Верес Корректор Г. РешетникЗаказ 5064/9 Тираж 655 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 отличающийся тем, что, с целью упрошения способа и сокрашения времени определения, инкубирование исследуемого образца, меченого гаптена, специфических антител осушеставляют одновременно с клетками карпуососсцв ангелов.