Способ количественного определения формононетина в растительных материалах

СОЮЗ СОВЕтсНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУ БЛИН 191 5 Р 4 С О 1 И ЕТЕНИЯ ательс.АРт 1 с,ичесаКте"1 ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ ОПИСАНИЕ(56) А.В.Вес 1 с, Аиз, д Вез.,964, 15, 223-230.Агаев Ф.Н. и др. Физиология ибиохимия культурных растений, 1984,т.16, 9 1, с.46-52,(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОРМОНОНЕТИНА В РАСТИТЕЛЬНЫХМАТЕРИАПАХ(57) Изобретение относится к химким способам анализа формононетинв растительных материалах и продутах их переработки. Целью изобрения является повышение чувствитель ности и точности определения. Из навески растительного материала этано лом извлекают фенольные соединения,упаривают экстракт до водного остатка, последний очищают петролейнымэфиром, упаривают досуха, гидролизуют 107.-ной серной кислотой. Из гидро".лизата извлекают этилацетатом фенольные соединения, разделяют их в тонкомслое силикагеля с использованием подвижной фазы состава хлороформ-мета-"нол-вода в соотношении (93-97)::(7-3):(0,5-1, 5) . Формононетин удаляют с хроматограммы и флуориметри"руют ( ф 254 нм 1450 нм) с добавлением к анализируемому раствору 0,03-0,21 мл 0,05 Мраствора гидроксйда натрия в метаноле.Чувствительность определения формононетина составляет 0,4-1,0 мкг/г.1409938 268 СУ(Ф-ФФ) а (Фо - ф,р) 11Изобретение относится к химическим методам анализа изофлавоноидов,их переработки и может быть исполь 5зовано для анализа формононетина иего гликозида - ононина в кормовыхтравах, и белковых концентратах изсока трав, в фармацевтических препаратах, при селекции люцерны и клевера по химическому составу и определении их экстрогенной активности.Цель изобретения - повышениечувствительности и точности способа,Проводят экстракцию фенольных сое,15динений смесью этанола и воды, упаривание, очистку и гидролиз экстрактареэкстракцию флавоноидов органическимрастворителем, хроматографированиеэкстракта на пластинке со слоем силикагеля в подвижной фазе, элюирование формононетина с пластинки. Вкачестве подвижной фазы используют. систему растворителей хлороформ - ме,танол - вода при объемном соотноше" 25нии компонентов (93-97):(7-3):(О 51,5), а количество формононетина оп-.ределяют флуориметрическим способомпосле добавления к элюату 003 -0,21 мл 0,05 М раствора гидроксида 30натрия в метаноле,При флуориметрировании элюата используют фильтр возбуждения254 нм, фильтры пропусканиящ450 нм. Чувствительность определения формононетина составляет от 0,4/,муке.с 10Навеску люцерновой муки 10 г экстрагируют 40-50 мл 902-ного этанолана глицериновой или водяной бане(й60-70 С) в колбе с обратнымхолодильником в течение 20-30 мин. 45Извлечение повторяют 4-5 раз. Полученные экстракты объединяют, отфильт"ровывают и упаривают до водного остатка. Последний очищают в делительной воронке петролейным эфиром 56 порциями (по 50 мл) до тех пор,пока органическая фаза не становится бесцветной или слабо-желтой. Очищенный водный остаток упаривают нароторном вакуумном испарителе досуха,гидролизуют его при нагревании в те . 55чение 3 ч с 5-10 мл 10-ной сернойкислоты. Агликоны фенольных соедине, ний извлекают из гидролизата 5-6 порциями этилацетата. Этилацетатные экстракты объединяют, упаривают досуха, растворяют в 5 мл метанола. Аликво" ту 0,01 мл метанольного раствора наносят в виде полосы на хроматографическую пластинку "Силуфол", предварительно промытую метанолом и активи" рованную нагреванием в течение 30 мин при 120 фС.Разделение проводят в камере с насыщенной атмосферой в системе растворителей хлорофом - метанол - вода (95 ф 5:1). По окончании разделенйя пластинку сушат на воздухе 5-10 мин, на 1-2 мин опускают в камеру, насыщенную парами аммиака, а затем облучают УФ-светом Я = 253 нм. Формононетин обнаруживают по светло-голубой флуоресценции с помощью метки-свидетеля или по величине К0,2710,02, Флуоресцирующую в УФ-свете полосу очерчивают. Соскребают силикагель с анализируемым веществом с 1 роматографической пластинки и .заливают 5 мл химически чистого метанола.- Смесь периодически встряхивают, Адсорбент выдерживают в контакте с растворителем в течение 12-15 ч. Затем силика гель отделяют, используя мелкопористый бумажный фильтр. Добавляют к фильтрату 0,05 мл 0,05 М раствора МаОН в метаноле и измеряют флуоресценцию полученного раствора, Проводят аналогичные процедуры для растворов сравнения - стандартного и фонового.Содержание формононетина в растительном сырье определяют по формуле где Х - содержание формононетина врастительном сырье, мг/г;286 - молекулярная масса формононетина;У - объем метанола для растворения сухого остатка суммыфенольных соединений (5 мл)Са - концентрация стандартногораствора, моль/л;а - навеска растительного материала, г;Ф - интенсивность флуоресцен",ции исследуемого раствора;Ф - интенсивность флуоресценции стандартного раствора;Ф - интенсивность флуоресценции фонового раствора,9938 2 У 268 С о (фа- фп) оном он а (Ф, - ф ) 5 где Х,общее содержание формононетина (гликозид + агликон,раствор А)содержание свободного формононетина (агликон, раствор Б);содержание гликозида фор -мононетина-анонина;интенсивность флуоресценции раствора А;интенсивность флуоресценции раствора Б (после обработки, так же, как впримере 1, исключая стадиюгидролиза) Хп 10 ононнн 15 20 Фо рмул а изобретения Составитель Н.КостюнинаРедактор И.Касарда Техред М.Дидык Корректор М.Пожо Заказ 3474(40 Тираж 847 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4(5:0,1 мл раствора формононетинаизвестной концентрации наносят напластинку и подвергают хроматографическому разделению так же; как впримере 1 . Все последующие процедуры проводят так же, как и для исследуемых экстрактов,Фоновый раствор приготавливают поуказанной методике из чистого силикагеля, удаляемого с пластинки с площади, примерно равной площади полосформоноиетина на исследуемых хроматограммах. Использование фоновогораствора необходимо при измеренияхна однолучевых флуориметрах, В двулучевых приборах фоновые растворы использовать не нужно: флуоресценциирастворителя, кюветы и примесей силикагеля учитываются автоматически.П р и м е р 3. Одновременное определение количества формононетина иононина 17-глюкозида формононетина).Извлечение фенольных соединений иочистка экстракта от липидов и хлорофиллов проводятся так же, как в примере 1, Очищенный экстракт упаривают до 20-30 мл, количественно переносят в мерную колбу на 1 00 мл,доводят этанолом до метки и разделяют полученный раствор на две равныечасти А и Б.Часть А упаривают досуха и гидролизуют. Затем повторяют все опера ции указанные в примере 1. Часть Бобрабатывают в той же последовательности, за исключением стадии гидролиза, Обнаруженное в растворе Б количество изофлавона соответствует содержанию в растительном сырье свободного формононетина - агликона,Количество ононина вычисляют поформуле Способ количественного определения формононетина в растительныхматериалах, включающий экстракциюфенольных соединений смесью этанолаи воды, упариваниеочистку и гидролиз экстракта, реэкстракцию флавоноидов органическим растворителем,.хро"Фматографирование. экстракта на пластинке со слоем силикагеля в подвиж"ной фазе, содержащей хлороформ, элюирование формононетина с пластинкис последующим количественным опредеЗ 5 лением, а т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повьппения чувствительности и точности способа, в качестве подвижной фазы используют систему40растворителей хлороформ - метанол -вода при объемном соотношении компонентов (93-97):(7-3):(05-1,5), вколичество формононетина ойределяютфлуориметрическим способом после добавления к элюату 0,03-0,21 мл 0,05 Мраствора гидроксида натрия в метано.ле,