Способ получения липидов, обладающих хемотаксическим действием

4(51) С 12 Р 7/64 С 12 К ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ .;,; ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАН ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ АВтОРСНОМУ СЙИДИВЪСтВУ(71) 1-й Московский ордена Ленина иордена Трудового Красного Знаменимедицинский институт им. И.М.Сеченова(56) 1. Авторское свидетельство СССРВ 228649, кл. С 12 Р 7/64, 1966.2. Уа 11 сег Е.С Еопез К.2.,Кеггу В.Е И 1 зоп М.Н, "Адчапвезп Ргозга 81 апй 1 п апд ТЬгошЬохапе.КевагсЬ", В 6, И.Е.Катеп Ргезв, 1980,с. 107-109.(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПИДОВ,ОБЛАЦАЮЩИХ ХЕМОТАКСИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМо т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повышения выхода липидов, выращиванию подвергают штамм грибовРцзагшш запйцс 1 пцш ВКМ Гнапитательной среде, содержащей источники углерода, азота .и фосфора, приаэрации воздухом, составляющей 0,81,2 л/л/мин, с последующим отделением биомассы и выделением целевогопродукта,Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именнок микробиологическому способу получения липидов, обладающих хемотаксическим действием. 5Липиды, содержащие эпокси-оксипроизводные полиненасышенных жирныхкислот, обладающие хемотаксическимдействием для полиморфноядерных .лейкоцитов, могут быть использованы 10как средство для усиления иммунногоответа организма при онкологическихи почечных заболеваниях .Известен способ получения липидов, предусматривающий культивирование грибов 1 .Полученные при этом липиды не обладают хемотаксическим действием,Известен способ получения липидов,обладающих хемотаксическим действием, 20согласно которому арахидоновую кислоту инкубируют с тромбоцитами, выделенными из крови животных с последующим выделением 10-окси, 12 эпокси,8, 14-эйкозатриеновой кислоты, обладающей хемотаксическим действиемНедостатком способа является егосложность, связанная с трудностьюполучения тромбоцитов и арахидоновой З 0кислоты высокой степени чистоты.Цель изобретения - повышение выхода липидов,Указанная цель достигается тем,что согласно способу получения ли- З 5пидов, обладающих хемотаксическимдействием, выращиванию подвергаютштамм грибов Ризагштп зашЬцсЫцш ВКМРна питательной среде, содержащей источники углерода, азота и Фосфора, при аэрации воздухом, составляющей 0,8-1,2 л/л/мин, с последующим отделением биомассы и выделением целевого продукта.Способ осуществляют следующим образом,Гриб Рцзагдшн зашЬцсхпщп ЗКМ Р выращивают на жидкой питательной среде при аэрации 0,8-1,2 л/л/мин, Изменение аэрации в сторону уменьшения илиувеличения указанного интервала приводит к уменьшению выхода липидов.После завершения Ферментации биомассу отделяют, высушивают на возду хе и измельчают до порошкообразного состояния. Липиды экстрагируют органическими растворителями и анализируют с помощью газовой хроматограФии.П р и м е р 1, Мицелий гриба Рцзаг 1 цш зашЬиспцш ВКМ Рвыращиваютв ферментационном аппарате объемом250 л (рабочий объем 125 л) на питательной среде, содержащей 0,257 картофельного крахмала, 27. сахарозы,О, 15 однозамещенного фосфорнокислого калия, 0,37 азотнокислого аммония,в периодическом режиме в течение36 ч при 26 С, скорости аэрированияо1,0 л/л/мин и постоянном перемешивании (скорость оборотов мешалки126 об/мин),После завершения ферментации мицелиальную биомассу отделяют от культуральной жидкости на вакуумном фильтре и получают 6375 г прессованнойбиомассы, которую далее высушиваютона воздухе при 28-30 С в течение24 ч и измельчают в измельчителетканей при 700 об/мин до порошкообразного состояния, К 630 г получен-ной сухой биомассы добавляют 150 мл2 Е-ного раствора додецилсульфата натрия, перемешивают в течение 10 мин,добавляют 36 л смеси этанол-эфир(1:1) и экстрагируют липиды при перемешивании в реакторе в течение 6 чопри 26-28 С. Остаток отделяют фильтрованием и фильтрат упаривают сначала в вакуумном испарителе типа "Яшах" до объема 600 мл затем на ро 0торном испарителе в вакууме при 35 Сдо сухого остатка, Получают 99,5 глипидов (15,0 г в 100 г сухой биомассы) .Для определения содержания жирныхкислот в липидах проводят гндролиз .полученного экстракта, Образец обезвоженных липидов ( 1 г) гидролизуют10 мл 1 н. ЧаОН в метаноле в течение1 ч при 30 С. По окончании гидролизаОдобавляют к смеси 10 мл натрий-Фосфатного буфера (рН=8,0) и экстрагируют смесь 3 раза порциями по 15 млгептаном, подкисляют водно-метанольный остаток 2 н. НСР до рН=3,8-4,0и экстрагируют 3 раза порциями по15 мл хлороформом. Хлороформенныеэкстракты объединяют и упаривают нароторном испарителе в вакууме досуха, Получают смесь жирных кислот вколичестве 0,29 г,Жирные кислоты в виде метиловыхэфиров анализируют газохроматографически (ГЖХ) на хроматографе марки11371 3ЛХММЦ (модель 3) с плазменноионизационным детектором и в видетриметилсилильных производных метиловых эфиров методом хромато-масспектрометрии на приборе НРВ.Условия при.ГЖХ-анализе: стекляннаяколонка длиной 2 м с стационарнойфазой 157 реоплекс на хроматоне ИАЮНМД 5, температура колонки 200 С, темапература испарителя 250 С, скорость 1 Огаза-носителя (азот) 30 мл/мин. Условия при хромасс-анализе: капиллярная колонка дпиной 25 м с привитойфазой ОЧ(ЗЖ), программированиетемпературы от 210 до 270 С (5 С в 15о омин), скорость газа-носителя (гелия)36 мл/мин, энергия ионизации 70 е МВ составе жирных кислот обнаружены: 8,9-эпокси-окси, 12-зйкозадиеновая кислота, 7,8-эпокси-окси, 2013-октадекадиеновая кислота, 7,8 эпокси-окси,13-гексадекадиеноваякислота. Количество отдельных кислотопределяют методом нормализации похроматограммам, подсчитывая плошади 25пиков.Содержание жирных оксикислот в липидах гриба составляет 0,42 г, чтов пересчете на 100 г сухой биомассысоставляет 0,066 г.30П р и м е р 2. Мицелий гриба выращивают в режиме, аналогичном примеру 1, на среде следующего состава,Е: осахаренный картофельный крахмал,в 100 г сухой биомассы), содержащих 0,33 г оксикислот (0,054 г/100 гсухой биомассы).П р и м е р 3. Мицелий гриба выращивают в режиме, аналогичном примеру1, на среде, содержащей, Х: сахарозудрожжевой автопизат 0 25 КН РО 40,15, НННО 0,3. Получают 580 г 45сухой биомассы и 76,4 г липидов(13,0 г в 100 г сухой биомассы), содержащих 0,36 г оксикислот (0,063 г/100 г сухой биомассы),П Р и м е Р 4, Мицелий гриба выращивают на питательной среде следующего состава, 7.: дрожжевой автолизат О,З; этанол 3,5, однозамещенный фосфорнокислый калий 0,06, азотнокислый аммоний 0,03, двузамещенный55фосфорнокислый натрий 0,06, хлорис 04 4тый магний 0,03, сернокислый цинк 0,005, хлористый кобальт 0,002, Получают 687,5 г сухой биомассы и 103,0 г липидов (15,0 г-в 100 г сухой биомассы), содержащих 0,87 г оксикислот (О, 122/ 100 г сухой биомассы).П р и м е р 5, .Культивирование гриба осуществляют на питательной среде, аналогичной примеру 4, при скорости подачи воздуха 0,8 л/л/мин. Выход сухой биомассы составляет 530 г и липидов 71,4 г (13,5 г/100 г сухой биомассы), содержащих 0,5 г оксикислот (0,094 г в 100 г сухой биомассы) .П р и м е р 6. Культивирование гриба проводят на питательной среде, аналогичной примеру 4, при скорости подачи воздуха 1,2 л/л/мин. Выход биомассы составляет 625 г и липидов 62,0 г (9,9 г в 100 г сухой биомассы) .П р и и е р 7. Определение хемотаксической активности.Хемотаксис лейкоцитов наблюдают под влиянием липидов, содержащих жирные оксикислоты. Пластичные камеры объемом 2,5 мл, заполненные 2 мл раствора Тироде, доведенного до РН= 7,4 добавлением раствора бикарбоната натрия, с .70 мкг/мл липидов или без них, помещают над кожными ссадинами, сделанными на спинах кроликов и прикрепляют медицинским клеем. Через 5 ч камеры с жидкостью удаляют, Содержание лейкоцитов, находящихся в камерах, определяют, используя камеру Горяева, под микроскопом. Содержание лейкоцитов в опыте составляет: 243000 + 860 и в контроле 1600 + 300.Увеличение содержания лейкоцитов под влиянием липидов, содержащих эпокси-гидроксипроизводные ненасыщен" ных жирных кислот, свидетельствует о наЛичии у них хемотаксического действия по отношению к ле"коцитам. Таким образом, предлагаемый способ получения липидов, содержащих эпокси-оксипроизводнь 1 е полиненг .ыщенных жирных кислот, обладающих хемотаксическим действием, позволяет значительно упростить процесс получения и получать липиды в больиит количествах.