Способ моделирования недостаточности тимуса

(19) .О ( 9 В 23/28 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН АВТОРСКОМ ИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Ростовский государственный фдна Дружбы народов медицинский ин 4 титут(54) (57) СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯНЕДОСТАТОЧНОСТИ ТИМ УСА путемвведения антигена, о т л и ч а ю ш и йс я тем, что, с целью создания модели,адекватной клиническому эквивалентуживотное в области селезенки предварительно подвергают воздействию ультразвука с частотой 65 кГц, амплитудой3 5 мкм, экспозицией 40-60 с и вводят белковое вещество с молекулярнымвесом 150000, полученное из гетерогенной лимфоидной ткани, в, дозе 100200 мкг,15 1 1040Изобретение относится к эксперимен-.тальной медицине,а именнок иммунологиии патофизиопогии и может найти применение цля моцелирования забопеваний,сопроважцаюшихся недостаточностью 5, тимуса,Известен способ мопепирования нецостаточности тимуса нутем ввеценияантигена 1Оцнако использование бопьших поз 1 Оантигена цля моцепирования процесса,многократность введения цля созцаниястойкой гилофункции тимуса, ведет, кпоцавлению противомикробного иммунитета и повышению чувствитепьностиоргащзма к инфекции.Цепь изобретения - создание .моцепн ацекватной кпиническому эквивапенту.Поставпенная цель достигается тем, щчто в способе моделирования недостаточности тимуса путем введения антигена животное в обпасти сепезенки прецваритепьно подвергают воздействию улыразвука с частотой 65 кГц, амплиту- р 5дой 3-5 мкм, экспозицией 40-60 с,затем ввоцят бепковое вещество с мо-пекулярным весом 150000, подученноеиз гетерогенной лимфоицной ткани в цо,зе 100-200 мкг.30Способ осуществляют спецуюшимобразом.Дпя осуществления способа экспериментапьных животных (мыши СВА) подвергают цействию ультразвука в областисепезенки с частотой 65 кГц, амплитуцой 3-5 мкм, .экспозицией 40-60 с.Контактной срецой между вопновоцоми поцопытным животным спужит цегазированное вазепиновое маспо. Затем сразу вводят белковое вещество с МВ.;150000, попученное из лимфоицной ткани в дозе 100-200 мкг,Для получения белкового веществастерипьно забирают лимфатические узлы у 5 кроликов. 10 г лимфатическихузлов расщепляют в 10 мп лимфатических узлов расщепляют в 10 мп физиопогического раствора. Подученную кпеточиую взвесь фильтруют через капроновую50ткань. Концентрация клеток составпяет2,5-3 10 /мп, Отцримеси эритроцитов8освобождаются с помощью осмотическогошока: к осадку кпеток добавляют 2 мпцистиплированной воды и 15 с пипетируют, затем добавляют среду 199 и концен-55траиию клеток доводят до первоначальной(2,5-3. 10"/мп). Полученную клеточнуювзвесь поцвергают ультразвуковой об 510 1работке в течение 1,5 мин на ультразвуковом генераторе. Взвесь центрифу. гируют на ультрацентрифуге 1 ч 20 мин. Супернатант пропускшот на колонке с Сефацексом С. Полученную бепковую фракцию с МВ 150000 концентрируют на приборе "Амиконф цо содержания бепка 3 мг/мп и используют в качестве антигена.Поспе введения белкового вещества в цозе 100-200 мкг мышам, подвергнутым действию упьтразвука, животных забивают на 7,14, 30 сутки после иммунизации. Для контроля прпученных изменений у животных изучают содержание Т- и В-лимфоцитов в крови, а также провоцят морфологическое изучение тимуса. Экстирпированный тимус фиксируют в 10%-ном растворе нейтрального формалина. Серийные парафиновые срезы окрашивают гематоксилин-эозином.Провеценные исспецования показывают, что при введении мышам подвергнутымРцействию ультразвука в обпасти селезенки, белкового вещества из пимфоицной ткани с МВ 150000 в дозе 100-200 мкгдразвивается недостаточность тимуса, характеризующаяся выраженной перестройкой систоструктуры тимуса, заключак щейся в редукции коры, разрастании участков соединительной ткани и замещении ими лимфоицных эпементов корковых отцепов тимуса, и, как спецствие этих изменений, снижение количества Т- пимфоцитов в крови.П р и м е р 1, 15 мышей пинии СВА, ведом 14 г, подвергают действию упьт развука в обпасти селезенки (частота .65 кГц, амплитуда 3 мкм, экспозиция 20 с), затем им вводят 50 мкг бепкового вещества из пимфоицной ткани с МВ 150000, На 7,14 30 сутки забивают по 5 мышей путем декапитации.Экстерпированный тимус фиксируют в растворе 10 О-ного нейтрального формалина. Серийные парафиновые срезы топшиной 5-6 мк,окрашивают гематоксипинэозином. В периферической крови исследуют количество Т- и В-РОК.У мышей, забитых на 7 сут, в ти,мусе отмечапась незначитепьная редукция коркового :споя за счет уменьшения числа лимфоицных эпементов. У мышей, забитых на 14 и 30 сутки, гистоструктура тимуса не отличалась от таковой у интактных животных, Количество Т- лимфоцитов в крови у мышей, забитых на 7 сут, не отличалось от контропяНа 14 сут у забитых экспериментапь510 4 Тираж 488 Подписное Филиал ЛПП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 3 1040ных животных количество Т-РОК снижа-пась на 11% а у мышей забитых на30 сут, нормализовалось - 42 %, Чиспо В-пимфоцитов у мышей, забитых на7,14 и 30 сутки, изменяпось нецостоверно,На основании полученных цанныхсделано заключение об отсутствии изменений, свидетельствующих о развитиинедостаточности тимуса. ,10П р и м е р 2. 15 мышей линии СВА,массой 14 г, поцвергают возцействиюультразвука в области селезенки (частота 65 кГп, амплитуда 3 мкм, экспозигция 40 с), затем им вводят 100 мкг 15белкового вещества из пимфоицной ткани с МВ 150000. На.7,14 и 30 суткизабивают по 5 мышей путем декапитапии. -Экстирпированный тимус фиксируют в10%-ном растворе нейтрального форма20лина. Серийные парафиновые срезы толщиной 5-6 мк, окрашивают гематоксипин-эозином. В периферической кровЬисслецуют количество Т- и В-РОК,Приморфопогическом изучении тимуса у: 25мышей, забитых на 7 сут, отмечалосьопустошение коры тимуса за счет уменьшедя количества тимодитов и гиперппазия ретикупярных клеток. У мышей,забитых на 14 сут, отмечапось болев ЗОвыраженное опустошение корковой зоныпо сравнениюс изменениями у мышей, .забитых на 7 сут, Выявлено мепкоочаговое разрастание кпеток соецщптепьной ткани, У мышей, забитых на30 цень,разрастание клеток ретикупо-.энцотепия было повсеместным. В периферической крови у мышей, за битых на 7 цень, отмечапось снижение количества Т-пимфоцитов на н% по сравнению с интактными животными, У мышей, забитых на 14 и 30 сут, чиспоТ-пимфоцитов было низким, 28% и 16% соответственно. Копичество В-пимфопи тов было повышенным у животных, за:в: битых на все исследуемые сроки. Уызаиные изменения свидетельствуют о раэ витии недостаточности тимуса, сопровож- давшейся опустошением корковой зоны тимуса за счет уменьшения числа жмоцитов и соответственно снижением ВНИИПИ Заказ 6934/53 количества Т-нимфоцитов в периферической крови.П р и м е р 3. 15. мышей линии СВА, массой 14 г, подвергают возцействию упьтразвука в области селезенки (час тота 65 кШ амплитуда 5 мкм, экспозиция 60 с), затем им вводят 200 мкг белкового вещества из пимфоицной ткани с МВ 150000. На 7,14 и 30 сутки забивают по 5 мышей путем цекапитации, Экстирпированный тимус фиксируют в 100 о-ном растворе нейтрального формапина. Серийные парафиновые срезы топшиной 5-6 мк окрашивают гематоксипинэозином. В периферической крови исспецуют копичество Т- и ВРОК. В тимусе при морфопогическом исследовании у мышей, забитых на 7 сут, отмечалось выраженное опустошение коры тимуса за счет резкого уменьшения чиспа пимфоцитов и обнажение ретикупярного осто-, ва, а также расширение границ мозг вого споя за счет увеличения пимфоицных элементов. У мышей, забитых на 14 сут, отмечалось более выраженное уменьшение числа тимодитов в коре, разрастание соединитепьнотканных эпементов, У мышей, забитых на 30 сут отмечалась редукция коры тимуса и смещение корковых отцепов ретикупо-энцотепиапьными клетками.В периферической крови отмечапи цоотоверное снижение копичества пимфоцитов у мышей, забитых на все исспецуемые сроки (16% на 7 сут, 20% на 14 сут, 9% на 30 суф Копичество В-пимфоцитов у мышей, забитых на 7, ,14 и 30 сутки, более чем вцвое превышает фоновые значения что свицетепьсьвует о нарушении супрессорной функции Т-пимфоцитов и увеличении популяции В- пимфоцитов, вырабатывающих аутоантитела. Полученные данные подтвердили развитие недостаточности тимуса.Прецпагаемый способ позволяет создать моцепь недостаточности тимуса наиболее ацекватной ее клиническому экви валенту. Использование црецпагаемого способаобусповпивает созцание модели, сопровождающейся изолированным поврежцениемТ-системы иммунитета.