Способ определения степени дисперсности хроматина в ядрах клеток

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНРЕСПУБЛИК ОЮ С 11) 1 Н 8/О 3/00 30 ЕТЕ ЕТЕЛЬСТВУ ВТОРСНОМ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТМ 1(71) Институт меащинской генетики(86) 1 Райков И. Б, Ядро простейщваЛ., "Наука", 1978, с. 39-42,2. Ьбгвег Р., АЬпауг и, Соггеа 1 орбейиеей посеаг вогУо 1 у апд гайе оУ)(84) (87) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ДИСПЕРСНОСТИ ХРОМАТИНА В ЯД РАХ КЛЕТОК, включающий введение меткй в хроматин ядра и регистрацию интенсивности выходящего излучения, о т л и ч а - . ю щ и й с я тем, что, с дальюповьаиения точности и увеличения скорости иэмерешй, вводят метку в виде изотопного источника ионизирующего излучения, после регистрааии интенсивности выходящего излучения разрушают ядро клетки до уровня-отдельньк.молекул, дополнительно регистрируют ннтенснвйость выходящего излучейия:и по соотношению результатов измеренуй ежа о степени диспврсности хроматийа ядра влетки. ЯИзобретение относится к молекулярнойбиологии, позволяет определять размерымикроскопических структур и может бытьиспользовано в различных областях биологии и медицины для анализа структурного состояния хроматина по характеристикам его дисперсности в ядрах клетокв норме и при патологии.Известны способы определения степенидисперсности хроматина в ядрах клетокпутем введения в хроматин ядра специфической для компонент хроматина погло;щаюшей или.флоуресцирующей метки ивизуальной регистрации выходящего светового излучения с помощью микроскопии 13,Однакоэти способы не позволяют полу-чить метрологически достоверных результатов, поскольку основаны на субъективном характере измерений; 20Наиболее близким к изобретению является способ определения степени дисперсности, хроматина в ядрах клеток,включающий введение флоуресцирующейметки в хроматин ядра и регистрацию интенсивности выходящет о излучения, сктврование исследуемой области, фотометрирование выходящего излучения и нахождение расчетным путем параметра, характеризующего степень дисперсности 2.Однако хотя указанный способ позволяет получить количественные результаты,точность определения параметров дисперсности с его помощью мала и ограничивается разрешающей способностью микроскопа, размером зонда и величиной шага сканирования. Из-за необходимостисканирования время измерения, необходимое для получения статически достоверного резу 1 ьтата является продолжитель 40дым. Кроме того, сведение объемногообъекта к его двухмерной проекции, существенно снижает точность определенияпараметров дисперсности,Пелью изобретения является повыше 45ние точности и скорости измерений.Поставленная цель достигается тем,что согласно способу определения степе-ни дисперсностихроматина в ядре клетки, включающему введение метки в хроматин ядра и регистрацию интенсивности: выходящего излучения, вводят метку ввиде изотопного источника ионизирующего излучения, после регистрации интенсивности выходящего излучения разрушаютядро клетки до уровня отдельных молекул, дополнительно регистрируют интенсивность выходящего излучения и по соотношению результатов измерений судят о степени дисперсности хроматина ядра клетки.Предлагаемый способ определения параметров дисперсности основан на устаноь ленной зависимости уровня поглощения излучения, испускаемого включенной в состав хромагина радиоактивной меткой, от размеров гранул хроматина. При изменении размера гранул меняется величина поглощенной ими энергии ионизирующего излучения и, соответственно, меняется интенсивность выходящего регистрируемого излучения, При полном разрушении клеток указанный эффект самопоглошения отсутствует. Сравнение уровней счета исходного препарата и разрушенного до молекулярного уровня позволяет определить величину поглощения, исходя из которой рассчитываются параметры дисперсности.Примером реализации способа является излучение степени дисперсности хрома тина фибропластов в норме и подвергнутых диспергируюшему воздействию - обработке раствором пониженной по сравнению с физиологической ионной силлой, В качестве метки использовался радиоактивный источник низкоэнергетического Ъ-излучения-тритий, который в составе Н-тимидина вводился в хроматин ядер клеток посредством внесения Н-тими 3дина в среду культивирования на 18-20 ч из расчета конечной радиоактивности 3- 5 мкКи в 1 мл среды.Клетки фиксировались, и невключившийся Н-тимидин отмывался.Регистрация ф -излучения осуществляласьь с помощью жидкостно-сцинтилляционного счетчика. Подготовленные препараты помешались в сцинтилляционный флакон с 15 мл сцинтиллятора и проводилась регистрация излучения. При этом сцинтиллятор проникает внутрь ядер клеток и основная часть 3-частиц, не потереявших свою энергию до контакта со сцинтиллятором, взаимодействует с последним внутри ядра. После регистрации осуществлялось разрушение клеток до молекулярного уровня путем гидролиза непосредственно в сцинтилляционном флаконе, причем сцинтиллятор удалялся и добавлялось 0,1 - 0,2 мл гидролизую щего раствора.К гидролизу добавлялось 15 мл сцинтилляционного раствора и вторично проводилась регистрация излучения. При указанном испытании получены следующие значения прироста скорости счета в результате гидролиэа характеризующие сгеЧ(Е) Е) Р 2(Е,т;Е)Е 1)ЗЕ, (1) Составитель Е. СидохинРедактор И. Николайчук Техред ОЯеце Корректор С. Шекмар Заказ 4028/34 Тираж 873 П одписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 з 10 пень поглощения 3-частиц хроматином в ядрах клеток: фибробласты в норме - 71%, подвергнутые диспергирующему воэдейс твию - 50%.При использовании для расчетов формулы (1), выражающей зависимость вероятности регистрации р-частиц от размеров гранул. получены следующие сред.ние размеры гранул хроматина: фибробласты в норме - 0,50 мкм, подвергнутые диспергирующему воэдействию - 0,33 мкм.РЮс 1 Х . ПОР1где Е -пороговое значение энергии. регистрации;Е ц- максимальная энергия р-частиц;9(Е ) - энергетическое распределениер -частиц;1,Е ) - эффективность регистрациир -частиц; 22019 4РЕ, г, - вероятность .вылета р -частиЕ Еро), цы иэ гранулы радиуса г сэнергией Е ) Ет,Предлагаемый способ позволяет определять характеристики дисперсности хроматина в ядрах клеток с учетом объемнойструктуры образца, что повышает достоверность и точность результатов по срав нению с известными способами, предполагаю 1 О шими анализ двухмерной проекции объемного образца.Кроме того,. использование предлагаемого способа повышает точность резуль татов иэмеренийпри меньшей трудоемкости15 их получения, вследствие отсутствияприсущих известным способам ограничений, накладываемых разрешающей способностью микроскопа (0,3 - 0,4 мкм),размером зонда и шага сканирования2 О (0,2 5-0,5 мкм), и возможности ьзмеренияв одном акте регистрации параметровбольшого числа (порядка 10 ) клетокпрн затратах времени на измерение около 1 мин, что значительно быстрее,25 чем по известному способу (в расчете .на одну клетку).