Способ определения глюкозы

Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ 1) Дополнительное к авт. свид-ву -2) Заявлено 04.07.80 (21) 2980917/23-04(53) УДК 543,42 .063 (088.8) Опубликовано 30.06. Дата опубликования Бюллетень Мо 24писания 05.07.82 в делаю нзобретений и открьпий. А. Пирузян Я. А. Александровский, Ю. В. дианов и 01 здвна Ленина институт химической физики ЛН СССР,(71) Заявитель ГЛЮКОЗ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛ Изобретение относится к аналитической биохимии и может быть использовано в научно-исследовательской работе, пищевой и микробиологической промышленностях, бродильном производстве, клинических исследованиях.Известен способ определения глюкозы путем внесения пробы анализируемого вещества в смесь, содержащую буферный раствор, глюкозооксидазу, пероксидазу и индикаторный субстрат - о-толуидин с последующим измерением плотности полученного раствора 1.Недостатком способа является его сложность, связанная с необходимостью введения двух ферментов, глюкозооксидазы и пероксидазы, что приводит к ограничению возможности использования способа.Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам к предлагаемому является способ определения глюкозы путем введения пробы анализируемого вещества в смесь, содержащую буферный раствор с рН 4 - 5, глюкозооксидазу и индикаторный субстрат - 2,6-дихлорфенолиндофенол с последующим измерением оптической плотности полученного раствора 2. 2Недостатком способа является его невысокая чувствительность (6 10 4 М) и точность (ошибка составляет 200/О).Цель изобретения - повышение чувствительности и точности способа.Поставленная цель достигается тем, чтов способе определения глюкозы путем внесения пробы анализируемого вещества в смесь, содержащую буферный раствор, глюкозооксидазу и индикаторный субстрат с последующим измерением оптической плотности полученного раствора, в качестве индикаторного субстрата используют Х,Х,1 Ч, М - тетраметил-и-фенилендиамин и процесс ведут при рН 73 - 8.Ион-радикальная соль М,1 Х 1,1 х 1, М - тетра метил-и-фенилендиамина имеет ярко-синееокрашивание (Ас= 606 нм), исчезающее при восстановлении, характеризуется высоким коэффициентом молярного погашения ( Е = 1,1 10 фМ см ), стабилен в течение длительного времени при рН 4,6,Пример 1. При проведении измерений вспектрофото метрическую кювету вносят 2,2 мл Ха-фосфатного буферного раствора (рН 7,7; 0.2 М), 0,3 мл рабочего раствора ион-радикальной соли М,Х, Х, 1 М - тетраметил940020 Таблица 2 Относительное стандартное отСреднее значени найден" ной кон Концентрация глюкозы в пробе, мг Ф Число изме- рений клонение центрации, мг б Таблица 1 Среднее ОтносительКонцентрация глюко зы в пробе, мг Ж Числ 5 4,5 0,07 7 11,4 0,05 4 23,8 0,02 4 50 0,02 15 изме- рений значениенайденной конное стандартное отклонение 10 ентра 25 ии, г 4 ф 50 20 Разбавление в кювете в 53 раза. 0,06 10 0,04 11)3 формула изобретения 5 24,65 49,2 0,02 25 50 0,02 Составитель С. Хованская Редактор М. Голаковски Техред А. Бойкас Корректор Г. Огар Заказ 4657/64 Тираж 887 Подписное ВНИИ ПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4-п-фенилендиамина (0,164 мг/мл, рН 4,6), 0,1 мл раствора глюкозооксидазы (2 мг/мл). После проведения измерения начальной оптической плотности при 606 нм реакцию ини. циируют добавлением в раствор 50 мкл исследуемого раствора глюкозы. После завер. шения реакции (5 мин) регистрируют полное изменение оптической плотности. Концентрацию глюкозы рассчитывают из калибровочного графика зависимости изменения оптической плотности от концентрации глюкозы. Результаты анализа приведены в табл. 1. Разбавление в кювете в 53; раза. Пример 2. При проведении измерений в30 спектрофотометрическую кювету вносят 2,2 мл Ка-фосфатного буферного раствора (рН 7,6; 0,2 М), 0,3 мл рабочего раствора ион-радикальной соли М, М, М, 1 - тетраметил-и-фенилендиамина (О, 64 мг/мл, рН 4,6), 0,1 мл раствора глюкозооксидазы (2 мг/мл), фотометрирование реакции проводят при 606 нм. Реакцию инициируют добавлением в раствор 50 мкл исследуемого раствора глюкозы, О скорости реакции судят, измеряя тангенс угла наклона линейногоучаст ка графика зависимости величины оптичес. кой плотности от времени. Концентрацию глюкозы рассчитывают из калибровочного графика зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации глюкозы. Результаты анализа представлены в табл. 2. Способ определения глюкозы путем внесения пробы анализируемого вещества в смесь, содержащую буферный раствор, глюкозооксидазу и индикаторный субстрат с последующим измерением оптической плотности полученного раствора, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и точности способа, в качестве индикаторного субстрата используют К, М, М,М - тетраметил-и-фенилендиамин и процесс ведут при рН 7 3 - 8 О. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Патент США Ке29498,кл. 195 - 1035, опублик. 1977.2, Патент США3009862, кл.95 - 1035опублик. 1961 (прототип).