826247

ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУСоюз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено иЕОЯР 9 (21) 2811946/28-13 Ф) М с присоединением заявки Но 6 01 Н 33/84 Государственный комитет С С С"Р ио делам изобретений. и открытий(088.8) Опубликовано 300481, Бюллетень М 16 Дата опубликования описания 300481су 1 ,;е В,К. Козлов, РА. Маркосян и Л.В. Фил тМа - ." ЦЯ)(71) Заявитель Всесоюзный кардиологический научный центр Академии медицинских наук СССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОТНОСТИ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ГРАНУЛ ТРОМБОЦИТОВИзобретение относится к областимедицины, а именно к цитологическимисследованиям;и может быть использовано для оцЕнки свойств внутриклеточ 5ных гранул,Известен способ определения кислотности внутриклеточных гранул тромбоцитов путем выделения клеток споследующей их отмывкой и инкубацией в забуференной среде (1 1..Однако при известном способе возможно повреждение гранул органеллв процессе выделения, способ плоховоспроизводим и не обеспечиваетвысокой точности. 15Цель изобретения - повышение точности способа.Поставленная цель достигаетсяпутем выделения клеток, с последующей их отмывкой и инкубацией в забуференной среде, при зтом клетки инкубируют в среде, содержащей 3 10 Мкатионного флюоресцентного красителядо полного насыщения гранул индикатором, далее рН среды снижают и фиксируют рН среды, при котором перестает выделяться краситель из гранул,и по его величине определяют кислотность внутриклеточных гранул тромбоцитов. 2П р и м е р . Проводит определение внутреннего рН серотониновых гранул (5-НТ органелл) кровяных пластинок кролика. Для этого кровь получают пункцией сердца и стабилизируют в соотношении 9 г 1 кислым цитратом натрия (0,085 М цитрата натрия и 0,065 М лимонной кислоты). Посредством центрифугирования получают обогащенную тромбоцитами плазму. Затем клетки осаждают в течение 40 мин при 2000 об/мин и ресуспензируют в специально подобранной среде следующего состава: на 250 мп раствора берут 0,658 г ИаС 1; 0 946 г цитрата натрия,ф 0,451 г глюкозы;0,433 г Яд 504, 0,092 г СаС 150 мп (.0,1 М) фосфатного буфера (рй 7,4) и 750 ед. гепарина.К 6 клеточной суспензии добавляют 310 М акридинового оранжевого и инкубируют 15 мин К 2 мп суспензии содержащей 400-800 тыс.кл/миз добавляют 6 мп физиологического раствора. Для измерения флуоресценции смеси используют флуориметр, рН определяют злектрометрически. Добавляют по 15 мп 0,1 н. раствора НС 1 и через каждые 2 мин определяют флуоресценцию и рН раствора.828247 Формула изобретения ель С. Малютина ч Корректор М. Коста 3 фУирйж 907 ВНИИПЯ Государственногопо делам изобретений 113035, Иосква, Ж, Р Заказ 2368 писное комитета СССи открытийушская наб.,4/ Филиал ППП "Патент, г,ужгород, ул.Проектная, 4 На чертеже представлены графики зависимости интенсивности Флуоресценции от рН среды.После достижения определенной величины рН взвеси дальнейшего роста Флуоресценции не наблндается (кривая 1). Определещюе таким способОм значение рН.серотониновых гранул тромбоцитов кролика колеблетоя в пределах 5,2-5,8. При измерений одного и того же образца разница определений не превышает 0,05 ед. рН.,Инкубация суспензия отмытых 5-НТ органелл кровяных пластинок с серотанином и МН,1 С 1 приводит к защелачиванию их матрикса.Предлагаемым способом оценивают рН данных гранул у нативных клеток после воздействия 154 р М серотонина (кривая 2) и 15 в М МН 4 С 1 (кривая 3). ПолучеНные результаты совпадают с данными, полученными на суспензии 28 отмытых 5-НТ органелл.. Предлагаемый способ позволяет с высокой степенью точности оценивать внутреннийррН серотониновых гранул нативных, неразрушенных 25 тромбоцитов. Метод прост. Вго результаты не зависят и широких пределах от концентрации клеток в суспензии. точность способа может быть повышена при снижении количест-ву ва добавляемой кислоты (т.е. уменьСоставит едактор Е, Дичинская Техред Ьшение скачков внешнего рН) и работе с концентрированными суспензиями. Способ может найти широкое применение при диагностике тромбастений, связанных с нарушениями Функций серотониновых гранул пластинок. Способ определения кислотностивнутриклеточных гранул тромбоцитовпутем выделения клеток с последующей их отмывкой и инкубацией в забуференной среде, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, клетки инкубируют в среде, содержащей 310 Мкатионного Флюоресцентного красителя до,полного насыщения гранулиндикатором, далее рН среды снижают и Фиксируют рН среды,при которомперестает выделяться краситель изгранул и по его величине определяют кислотность внутриклеточныхгранул тромбоцитов.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе