Способ детектирования аминокислотпри хроматографическом анализе

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 19,0376 (21) 2335778/23-25с присоединением заявки Мо(51)М. Кл. 6 01 й 31/08 Государственный комитет СССР по делам изобретений н открытий(72) Авторы изобретения Ордена Трудового Красного Знамени институтвысокомолекулярных соединений АН СССР(54) СПОСОБ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ АМИНОКИСЛОТ ПРИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ Изобретение относится к области аналитической биохимии и может быть использовано при хроматографическом анализе аминокислот.Известен способ хроматографического анализа аминокислот, включающий обработку элюата нингидриновым реагентом следующего состава: нингидрин 20 г/л 5 пС 12 2 НО 0,38.г/л, растворитель метилцеллозольв + ацетатный буферный раствор рН 5,50 (3;1) и фотометрическую регистрацию окрашенного продукта (11 . При данном способе реакция аминокислот с нингидрином завершается в течение 15 мин при 100 С в проточном реакторе, откуда окрашенный продукт поступает для регистрации в проточную кювету фотометра.Известен также способ детектирования аминокислот при хроматографическом анализе на капиллярных колонках, включающий обработку элюата нингидриновым реагентом и фотометрическую регистрацию окрашенного продукта. Данный способ является близким к описываемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату. В известном способе нингидрированную реакцию с реагентом проводятпри 120-135 С, а во избежание закипания растворителя ставят на, выходеиз капилляра гидродинамическое сопротивление, обеспечивающее давлениев реакторе д 2,5 атм. В этих условиях время завершения реакции снижается до 6 мин прп 120 С и 1,5 минпри 135 С. При температурах выше130 С стабильность нингилрированного реагента понижается,что проявляется.в выделении осадка, засоряющего жидкостные коммуникации 2).15 Недостатком известных способовявляется длительность реакции и низкая чувствительность,Цель изобретения - ускорение иповышение чувствительности.20 Поставленная цель достигаетсятем, что в способе, включающем обработку элюата нингидриновым реагентом и фотометрическую регистрациюокрашенного продукта, используют 25 нинг,дриновый реагент, содержащий23-25 г/л нингидрина и 0,70-0,75 г/л5 пС 1 2 Н 20 в ацетатном буферномрастворе с рН 4,8-5,2.Экспериментальные исследования 30 показали, что нингидриновый реагент819712 Реакция осуществлялась в проточном реакторе из Фторопластового капилляра с внутренним диаметром0,8 мм, на выходе которого находилось гидродинамическое сопротивление - капилляр 0,3 мм, длиной 3,5 м,что достаточно для создания в реакторе давления 3 атм. Время реакциизадавалось скоростью подачи реагентов в смеситель (1 мл/мин для раствора аминокислоты и для нингидринового реактива) и изменением длиныреактора (10 сек при 33,5 см 1,5 минпри 302 см и 15 мин при 3 10 см).Прореагировавшая смесь на выходеиз реактора охлаждалась и направля лась в детектор-спектрофотометр сдлиной кюветы 1 см, где измерялась раэййца оптических плотностейпродукта реакции и разбавленноговдвое нингидринового реагента на 0 длине волны 570 нм для валина и440 нм для пролина.Изобретение позволяет ускорить,время завершения нингидриновойреакции и повысить чувствительностьхроматограФии аминокислот. 1,5 0,38 3,8,70 4,2 3: 0 Источ принятые во в 1. 5.Ноо.ге Апа 1. баев, 1 2. М.О,Апд 1.11,Но 11 ещап,26,. Р 1, 104ИИПИ Заказ 1371/23илиал ППП "Патент", г, Ужг ираж 907 писное ная, 4 од, ул, Прое предложенного состава термическиболее стабилен, чем нингидриновыйреагент известного состава. Использование предлагаемого реагента позволяет поднять температуру детектирования до 160"165 оС, причем вэтих условиях реакция завершается заболее короткое время (см. таблицу),что обеспечивает малый вклад размывания в реакторе в общее размываниехроматограФической эоны и позволяетповысить чувствительность. Иэ таблицы видно, что температура реакции 160-165 С является оптимальной, так как при дальнейшем по- вышении температуры возрастает термодеструкция окрашенного продукта. С другой стороны в области рН 4,8- 5,2 температура термодеструкции максимальна, а нингидриновый реагент отличается наибольшей стабильностью. Исследовалась реакция с нингидрином аминокислоты валин (концентрация 510 М) и иминокислоты пролин (концентрация 10 М). х - режим по прототипу хх - оптимальный режимФормула изобретения Способ детектирования аминокислот при хроматограФическом анализе на капиллярных колонках, включающий обработку элюата нингидриновым реагентом и Фотометрическую регистрацию окрашенного продукта, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью ускорения и повыоения чувствительности используют нингидриновый реагент,содержащий 23-25 г/л нингидрина и0,70-0,75 г/л 5 пС 2 Н О в ацетат 2ном буФерном растворе рН 4,8-5,2,ники инФормации,нимание при экспертизеО,Н.5 расМвоп, Ч.Н.51 е 1 п958, 30, 1185.егьоп, В,Н.5 йечепь,Апа 1. 81 осЬев 1968,