Способ получения ферментных препаратов лизоцимов из содержап1его их сырья

О П И С А Н И Е Г 78771ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Сове 5 ских Социалистических РеспубликЗависимое от авт. свидетельства Лсе Заявле о 17,11,1965 (еоз 943666,28-13с присоединением заявки М 1. 6 а, 225 Приорит МПК С 12 Комитет по делаю вобретеиий и открыти ори Совете твииистроо СССРУДК 663.18: 576,8.093.383 (088.8) 3,11,1966, Бюллетень М 4 Опубликовано Лата опубликования описания 19.11.1%,6 Авторыизобретеии А. Черкас вченко зелинского кН Сй 55,Институт органической химии имени Н аявите ПОСОБ ПОЛУГЕНИЯ ФЕРМЕНТНЪХ ПРЕПАРА 1 О ЛИЗОЦИМОВ ИЗ СОДЕРЖАЩЕГО ИХ СЫРЬЯ2 К группе лизоцимов относятся одктериолитические ферменты, которые разрушают бактерии, действуя на входящие в состав их клеточных стенок мукополисахариды.Известны способы получения фермецтных препаратов лизоцимов из содержащего их сырья, например белка куриного яйца, путе. смешивания его с голой и послелующей длсорбции хитином.Однако в сырье могут находиться и другс белки, способные сорбироваться:5 а хитине и тех же условиях, в которых сорбируется лизоцим. Это приводит к тому, что при совмес.- ном присутствии таких белков в сырье ца хитине сорбируется не один лизоцим, а сумм белков, имеющих сродство к хитицу, т. е. лизоцим, получегпый по известному способу, содержит еще белковые примеси.Предлагаемый способ обеспечивает получение фермептцых препаратог, лизоцимов без белковых примесей.Для этого ферментцые препараты десорбируют дистиллированной водой. Процесс ддсорбции хитином следует проводить путем пропуска раствора сырья или экстракта его через слой хитина в присутст 5 э 5 п МС с концентрацией 0,5 - 1,00/5 при рН 5,5.Для очистки выделенных водных растворов ферментных препаратов лизоцимов от низко- молекулярных небелковых примесей (ХаС 1) и продуктов частичного гилролиз хитиид олигасахарцлов (если оци есть) целесообрзцо провести повторцую длсорбцию раствора фермецтного препарата лизоцимд хитцох с последующей десорбцией его 0,5 - 1,01/и-ць 5 в растьорох уксусной кислоты. Пр 5: этом повторную алсорбцию рекомецлуется г 5 роводить г. присутствии 0,1 М натрий- или кдлийфосфатцого буферд при рН 7,9- - 8,0. Регецериро вать хитьп после Лесорбции ферме 5 тиого пренсРсгТс 1;Ц 530 ЦИМОВ ДИСТИЛ;иРОВИной ВОДО (т. е. пос,тс первой стадии) ц лесообрдзио 2 - - 5",-ць 5 х растворсм уксусной к 5 слот 5 г, После второй сталин хитрегенерируется том.- тически при лесороции лизоцкО; 0,5 - г,- иой уксус 5 ОЙ кислотой.ПреллГсе.5 ьц способ закл 50 чдется 5: с 5 е;гу -ющех.,Через колонку, цдпол 55 сциую хцтииох с рдз еров частиц 50250 55 к и уравновешеннуюс 0,5 1,0%-ць 5 х раствором С в дистиллированной воде, пропускают исходный волцосолегой рдствор сырья, содержащий лизоццсм В СХ;ССИ С СОП 1 ТСТВЮИИХИ ППИМЕСяМ;. 11 СХОд цый раствор лолжец солерждть кС концентрации цс менее 0,5 - 1,01 и иметь рН 5,5.В этих условиях,тизоцим целиком сорбиру- ЕТСЯ 55 ХИТИНЕ И ЗсЛЕРЖИВЕТС 5 И КОЛОНСЕ в то гремя кдк примеси проходят через колон ку, нс здлерживдясь. Здгем через колонкуМосква, Центр Гпио рзФии,пр, Сапунова, 2 пропускают 0,5 - 1,0%-цый раствор 1 заС 1 в дистиллированной воде, окончательно отмывая ее от примесей, а лизоцим продолжает оставаться на колонке, После этого через колонку пропускают дистиллированную воду, которая смывает с хитцпа лизоццм. Если собранный водный раствор лизоцима содержит следы ХаС и олигасахаридов - продуктов частичного гидролиза хитина (последние практически отсутствуют, когда процесс ьыделения ведут при температуре, примерно равной 4 С), то раствор повторно пропускают через колонку с хитином при рН 7,9 - 8,0. Для этого колонку уравновешивают с 0,1 М натрий- или калийфосфатцым буфером при рН 7,9 - 8,0, а раствор лизоццма, первично смытьш с колонки водой, забуферивают до тог) же значения рН и молярности, добавляя концентрированный буферпг.п 4 раствор или сухие соли в соответствующем количестве, Далее растгор лцзоцима пропускают через колонку, которую затем промывают дистиллироваппои водои. При этом удаляются соли и олигасахарцды, лизоцим же полностью осгается ца колонке. Смывают лизоцим с колонки, пропуская через нее 0,5 - 1,0%-цый раствор уксусной кислоты. Собранный раствор лизоцима высушивают обычным образом. Регеперируют колонку после первой стадии выделения лизоцима промыванием ее 2 - 5%-цым раствором уксусной кислоты; после второй стадии (в случае удаления солей и олигасахаридов цз лизоцпма) хптпн в колонке вегенер 1 руется автоматически при смьРации лцзоппма 0,5 1,0%-пой уксусной кислотой.П р ц м е р 1, Извлечение лизоцп аа цз белка куриного яйца. 20 мл цсльпого кури ого белка разбавляют 0,1 Ч раствором МаС 1 до объема 200 л 1,. Полученный водно-солевой раствор оелка, свооодный ог механических примесей, пропускают через колонку с размерамп 2 к,"20 см, наполненную хптицом с размером частиц 75.:-25 мо.гь, ург 1 новепсп 1 у 1 о предварительно с О, М раствором "."аС 1. После этого кочоцку промывают тем же 0,1 М раство- ром КаС 1, контролируя отмывк цз)1 еренцем оптической плотности раствора па волне 275 - 280 млгк па приборе СФ. 1 т",ог;1 а оптическа 11 плотность выходящего 113 колонки раствора СтаЛа РаВНа ПРактпьЕСК НУЧ 1 О (ПВОПУСТПЛЦ 1,5 л промывного растьора), через колонку пропускают дцстиллировагшую воду, смыгая лизоццм. Контроль за в 11 ходоб лизоццма вели так же, как коцтроль за отмывкой. Практически весь лизоцим выше, ме)кду 100 - 300,1 л ВОДЫ, т. Е, В 200 МЛ. ДОПОЛН 11 тЕЧЫПзгй КОП- троль за полнотой извлечения лизопцма цз исходного раствора проводят путем цз)лерецпя фермецтатпвцой активност: раствора. выходящего из колонки, как па стадии посадки иСоставптспь 1 сдактор Р. Чистоеа Тстрсд Л. А, КааившиикоЗаказ 555;4 Тираж 55 Е ьпопиа; и иЦННПП 11 Ксистста ио лепки пзобрессип промывания, так и на стадии смывания лизоцима водой. Активность измеряли турбидиметрическим методом, используя в качестве субстрата суспензию бактериальных клеток 5 Мгсгососсцз Г.гзог 1 е 1 И 1 сцв, обычно используемую для этих целей. Практически весь лизоцим, содержавшийся в исходном растворе, был извлечен при промывании колонки водой и вышел в объеме 100 мл.10 Предлагаемый способ позволяет также извлекать лизоцимы из более дешевого сырья, чем белок куриного яйца, например из хрена,П р и м е р 2, Извлечение лизоцима из хрена. 100 г хрена истирают на мелкой терке, 15 заливают 1 л воды и оставляют на 5 час прислабом перемешивании для полноты перехода лцзоцима в раствор. Затем отделяют раствор от механических примесей, добавляют ХаС 1 до концентрации 1% и полученный рас твор пропускают через колонку 2 Х 20 см с хитипом размером частиц 75+25 моль, уравновешенную с 1%-ным раствором КаС 1. Далее повторяют те же операции, что и при выделении л 14 зог 1 има из белка куриного яйца. Весь 25 лцзсцим, содержавшийся в исходном экст;)акте, был смыт с колонки водой и вышел в об.ьеме 150 мл. Предмет изобретения30 1, Способ получения ферментных препаратов лизоцимов из содержащего их сырья путем смешивания этого сырья с водой ц последующей адсорбции хитином, отличающийся тем, что, с целью получения ферментцых преЗ 5 паратов лизоцимов без белковых примесей, ихдесорбпруют дистиллированной водой.2. Способ по и. 1, отличаюигийся тем, чтопроцесс адсорбции хитицом проводят путем пропуска смешацного с водой сырья чер 1.з 40 слой хитина в присутствии МаС 1 с коццецтраццеи 0,5 - 1.0% и при рН 5,5.3. Способ го и. 1, отличвогиийся тем, что, сцелью возможности очистки выделенных водных рас;воров фермецтных препаратов лизо и;1 мов от ццзкомолекулярных цебелковых примесей, например ХаС 1, ц продуктов частичного гцдролпза хитпна - олигасахарцдов, в случае пх присутствия, проводят повторную адсорбццю раствора фермептцого препарата лц зоццма хитицом с последующей десорбциейего 0,5 - 1,0%-шям раствором уксусной кислоты.4. Способ по п, 3, отличаю 1 иийся тем, чтоповторную адсорбцию раствора ферментного препарата лпзоцима проводят и присутствии О,1,Л натрий- цли калцйфосфатцого буфера прп рН 7,9 - 8,0.5. Способ по п. 1, от.гичигощийгл тем, чторегепсраци 1 о хцтина проводят 2 - 5%-ны.,1 рас тво) Ом 1 ксспой кислоты. М, Аидрсеаава Коррскторьп т. Н. Костикова и Л. В. Марисиисб 11) Обпеьи 0,21 изд. д. ПодписиосЙ и отк 1 пизип при Совете Миипзтоов СССРпр. Серова, д. 4