Способ выявления углеводородокисляющих микромицетов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 786069 А 2 0 1/О ИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ СВИДЕТЕЛЬСТ АВТОР(56) Сапабап . ч. 22, р. 1209- (54) СПОСОБ ДОКИСЛЯЮЩ стном ляюОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР) юл, М 1 , В,Б,Скрибачилин, Т,С.Онирдукова, Г.А,Осипов и Т.П, Не оцгпа о 1 МсгоЬооду, 1976,213,ВЫЯВЛЕНИЯ УГЛЕВОДОРОИХ МИКРОМИЦЕТОВ Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для выявления углеводородокисляющих микромицетов, повреждающих нефтяные топлива,Известен способ выявления микроорганизмов-деструкторов неионогенных поверхностно-активных веществ (ПАВ), заключающийся в приготовлении питательной, среды, содержащей минеральные соли и ионогенные ПАВ в качестве единственного источника углерода и энергии, выращивании на ней культур испытываемых микроорганизмов и определения активных форм деструкторов по зоне просветления вокруг выросших колоний, Недостатками способа являются грудоемкость и длительность анализа, а также его низкая чувствительность и достоверность.Наиболее близким к изобретению является способ определения биодеградации нефти, по которому образцы нефти контаминируют микроорганизмами, экспонируют в течение 714 сут, а затем с помощью массспектрометрического метода определяют содержание в них различных компонентов. Способу присущи длительность испытаний и недостаточная точность,(57) Использование; биотехнология, индикация биоповреждений нефтяных топлив. Сущность изобретения; для выявления углеводородокисляющих микромицетов отбира- ют пробу нефтяного топлива, водного отстоя из топлива или этанольного экстракта из материалов, контактирующих с жидкой фазой, и по наличию в пробе циклогексанкарбоновой, фенилуксусной, фенилпропионовой и толуиловой кислот выявляют микромицеты класса Оетгогпусесез. ель изобретения -сокращение-времеределения и повышение точности споЦель достигается тем, что в изве способе выявления углеводородокис щих микромицетов, повреждающих нефтяные топлива, отбирают пробы топлива, водного отстоя из топлива или этанольного экстракта из материалов, контактирующих с жидкой фазой, и определяют в них наличие органических кислот, являющихся продуктами метаболизма углеводородокисляющих микромицетов, с помощью хроматомассспектроскопического метода.В основу предлагаемого способа поло. жен установленный экспериментально факт, что при наличии углеводородокисляющих микромицетов в топливе, водном отстое из топлива и этанольном экстракте из материалов, контактирующих с жидкой фазой, присутствуют органические кислоты, являющиеся продуктами метаболизма микромицетов.Так, например, в составе образцов водного отстоя и этанольного экстракта из герметика У-ЗОМЭС, контактировавшего с топливом, зараженным микроскопическимигрибами родов Сабозрог 1 цт гез 1 пае(11 пс 1 ац) бе Чг 1 ез, Ф, ачеИапеца, Реп 1 с 1 П 1 цвпа 191 очепз 1 з 1 аха, Асгегпоп 1 цгп К 11, Сглаз, обнаружены циклогексанкарбоновая, толуиловая, фенилпропионовая и фенилуксуснаякислоты, которые являются строго специфическими продуктами метаболизма чистыхкультур,Предлагаемый способ осуществляют вследующей"последовательности;отбирают пробу водного отстоя или этанольного экстракта;отобранную пробу подкисляют сернойкислотой до рН 2,3;проводят экстрагирование водной фазыдиэтиловым эфиром;упаривают экстракты и обрабатываютих силилирующим агентом;вводят пробы в испаритель хроматографа;производят запись хроматограмм имасс-спектров исследуемых проб;индикацию углеводородокисляющихмикромицетов проводят по наличию на хроматограммах и масс-спектрах пиков и линий,принадлежащих циклогексанкарбоновой, толуиловой, фенилпропионовой и Фенйлуксусной кислотам.Данная индикация может быть проведена и по наличию других соединений, относящихся к производным циклогексана,летучим жирным. дикарбоновым, ароматическим и дикарбоновым ароматическимкислотам, однако указанные органическиекислоты дают наиболее достоверный результат.Примеры конкретного выполнения.Хроматомасс-спектрометрический анализ,1, Пробу водного отстоя подкисляютсерной кислотой до рН 2,3, Затем к 12 млводной фазы добавляют 0,5,1,0 мл диэти-.лового эфира и экстрагируют в течение 35. мин при встряхивании. Эфирные экстрактыупаривают и обрабатывают 20 мкл бистриметилсилилтрифторацетамида ВЯТКА) в течение 1015 мин при 6065 С,Идентификацию состава пробы проводят методом хроматомасс-спектрометриина хроматомасс-спектрометре НРВ скапиллярной колонкой из плавленого кварца, внутренняя поверхность которой покрыта неподвижной фазой - метилсиликоноваяОЧ, Используют политермический ре. жим анализа при скорости изменения температуры 35 град/мин, В качествегаза-носителя используют гелий, скоростьпотока которого составляет через инжектор30,35 мл/мин, через колонку в масс-спект 20 25 ного и засоренного углеводородокисляю 30 35 40 50 ба, в качестве исследуемого материала используют нефтяное топливо, водный отстой из 51015 рометр 1,5.2,0 мл/мин, Запись спектров проводят непрерывно, Наличие продуктов метаболизма микромицетов в водном отстое свидетельствует о загрязнении ими топлива,2. Пробу материала, контактировавшего с жидкой фазой, измельчают механическим способом. Навеску массой 1,03,0 г помещают в аппарат Сокслета, добавляют 150 мл этанола и экстрагируют в течение 6 ч. После окончания экстрагирования экстракт декантируют, Затем 1 мл этанольного экстракта упаривают и обрабатывают 20 мкл ВЯТКА в течение 1015 мин при 6065 С,Индентификацию состава пробы этанольного экстракта проводят методом хроматомасс-спектрометрии по методике, описанной выше, Наличие продуктов метаболизма микромицетов в этанольных экстрактах материалов, контактировавших с жидкой Фазой, свидетельствует о загрязнении ими топлива, 3, Идентификацию состава проб исходщими микромицетами топлив проводят методом хроматомасс-спектрометрии пометодике, описанной выше,Для выделения спектров продуктов метаболизма из мешающего фона компонентов топлива используют метод компьютернойфильтрации, реализуемой с помощью ЭВМ. Предложенный способ выявления углеводородокисляющих микромицетов, повреждающих нефтяные топлива, обладает более высокой точностью и достоверностью за счет исследования продуктов метаболизма микромицетов на молекулярном уровне. Кроме того, сокращается время выявления углеводородокисляющих микромицетов продолжительность определения составляет 50 мин).Ф о р мула и зоб ре те ни я Способ выявления углеводородокисляющих микромицетов, включающий отбор пробы исследуемого материала и определение ее химического состава, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что, с целью сокращения времени определения и повышения точности спосотоплива или этанольный экстракт из материалов, контактирую цих с жидкой фазой, непосредственно в исследуемом материале определяют содержание циклогексанкарбоновой кислоты, толуиловой кислоты, фенилпропионовой кислоты и фенилуксусной кислоты и по их наличию выявляют микромицеты класса Ое 1 гогпусесез.