Способ культивирования хрящевых фрагментов

( 9) 111) 0 51) ГЕНИ ательскийеринарии и чТга ог сеИз пта оп о 1 пеа есогб,1983,(54) СПОС ЩЕВЫХ Ф ОСУДАР СТВ Е ННЫ И КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР ИСАНИЕ ИЗО ОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(56) ЯЬегтапп М. ес а1 гапз 1 ог 1 паТоп о 1 с)опс 3 гордепозтеоЬазиз апс сЬе 1 огп)атгпе 1 пЬгапе Ьопе, - . Апатоп)е206, М 4, р. 373 - 383,КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ХРЯ- ГМЕНТОВ Изобретение относится к области клеточной биологии и может быть использовано в медицинской и ветеринарной практике,Цель изобретения - повышение пролиферативной активности и улучшение дифференцировки клеток,П р и м е р 1, Подложки из костной ткани животных готовят следующим образом, Отбирают бедренные кости у 10-дневных цыплят и у 4 - 6-месячных крыс, помещают их в декальцинатор, состоящий из 2000-ного нитрата натрия и муравьиной кислоты в равных частях, После деминерализации бедренных костей у них отсекают эпифизы, удаляют костный мозг, очищают от мышечных волокон, после чего трижды промывают дистиллированной водой (по 20 мин), опускают в 96-градусный спирт на 5 ч для обезжиривания, После этого трижды промывают в дистиллированной воде (по 30 мин), два раза в растворе Хенкса с антибиотиками (по 20 мин), после чего переносят в питательную среду 199, содержащую 10(57) Изобретение относится к клеточной биологии и может быть использовано в медицинской и ветеринарной практике. Цель изобретения - повышение пролиферативной активности и улучшение дифференцировки клеток, Способ заключается в том, что хрящевые фрагменты культивируют на подложке из деминерализованной кости в жидкой питательной среде при 36 С в атмосфере воздуха с добавлением 50 СО 2 в течение 15 сут со сменой среды. В процессе культивирования через 10 сут наблюдается аппазиционный рост хряща, а через 15 сут культивирования - интерстициальный рост и активное деление молодых клеток,глюкозы, В этои питательнои среде и хранятся костные подложки при -4 С,П р и м е р 2. Хращевую ткань, получен- Я ную у 10-ти дневных крысят с головок бедренных костей, коленных суставов, межпозвоночных дисков тщательно отмывают в двух порциях среды 199 с антибиотиками, Осторожно отсекают лезвием бритвы прилежащие мышечные волокна, связки, Хрящ, взятый с головок бедренной кости, рассекают лезвием на четыре части, Межпозвоночные хрящевые диски и хрящевая ткань каленного сустава не рассекается, а высаживается в костное ложе подложек, получен н ых от 4-месячных крыс, таким образом, чтобы хрящевая ткань плотно прилегала к костному основание. Подложки с хрящевыми фрагментами укладывают в чашки Петри, где находится питательная среда 199 с добавлением 20-ной нормальной инактивированной сыворотки крупного рогатого скота. Культивирование проводят при 36 С в атмосфере воздуха с1611931 Формула изобретения35 Составитель А.РоманченкоРедактор Н.Бобкова Техред М.Моргентал Корректор А,Обручар Заказ 3813 Тираж 484 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 обавлением 5 СОг в течение 15 дней со меной среды каждые 48 ч, В течение перЙых двух дней хрящевая ткань сохраняет свою первоначальную структуру. Через пять суток культивирования наблюдается увеличение числа хондробластических клеток.Через десять суток культивирования наблюдается аппозиционный рост хряща, неифференцированные клетки на поверхности хряща пролиферируют и дифференцируются в молодые хрящевые клетки, Через 15 сут культивирования наблюдается интерстициальный рост хряща, молодые хрящевые клетки делятся, образуя ,клеточное гнездо, состоящее иэ двух или четырех клеток, т.е, хрящевые клетки клеточных гнезд представляют собой клоны, ;так как они являются потомством одной ис, ,ходной хрящевой клетки. П р и м е р 3, Бедренную кость с хря, щевыми эпифизами выделяют у 18-дневных куриных эмбрионов, отсекают лезвием бритвы прилежащие мыщечные волокна, связки, отмывают в двух порциях среды 199 с антибиотиками и укладывают в декальци, нированные косточки-подложки 10-дневных цыплят. Культивирование проводят как , описано в примере 1 в течение 15 сут, Мор; фологические особенности культивируемой костной ткани определяют на срезах,окрашенных гематоксилинэозином. Костная ткань после культивирования сохраняет свою цитоморфологическую характеристи ку. Остеобласты располагаются на поверх, ности кости и представляют собой крупные клетки с одиночным ядром, цитоплазма резко базофильна. У эпифиэарных пластинок наблюдается интерстициальный рост хряща.При культивировании эксплантатов мыщелков нижней челюсти 19 - 20-дневных зародышей мышей, содержащие чистый хрящ, на миллипоровых фильтрах в модифицированной среде Игла в течение 10 дней эффективность культивирования по 5 известному способу довольно низка, Так втечение первых 2 сут ткань хряща сохраняет свою первоначальную структуру. Через пять суток культивирования хондробластические клетки исчезают и весь хрящ заполня ют гипертрофированные хондроциты, амеэенхимальн ые клетки дифференцируются в остеобласти, которые продуцируют остеоид, По предлагаемому способу, начиная с пятого дня культивирования, наблюдается 15 увеличение числа хондробластических клеток и к 10-му дню наблюдается аппозиционный рост хряща с пролиферацией и дифференцировкой недифференцированных клеток, а к 15-му дню культивирования 20 наблюдается интерстициальный рост хряща.Добавочное влияние на индукцию хондрогенеэа в культуре клеток может играть морфогенетический белок, а также остеоин дуктивный фактор, содержащийся в деминерализованной кости, играющей роль в остеобразований и ч 1 сго.Использование способа позволяет с высокой эффективностью получить рост клеток 30 в хрящевых эксплантатах, которые могутбыть использованы в медицине и ветеринарии для регенерации суставных хрящей,Способ культивирования хрящевыхфрагментов, включающий выращивание их на подложках в жидкой питательной среде, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью 40 повышения пролиферативной активности иулучшения дифференцировки клеток, в качестве подложки используют деминерализованную костную ткань животных.