Способ подготовки биологических объектов к электронно микроскопическим исследованиям

О П И С А Н И Е (1004805ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(23) Приоритет Опубликовано 15, 03. 83. Б)оллетень1 ОДата опубликования описания 15.03,83(088.8) па аелзи нзобратеннй н открытий(72) Авторы изобретения Б. А, Скорняков и Т. П. Говоруха Институт проблем криобиологии и криомедицинь) АН Украинской ССР( 51) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ К ЗЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКИМ ИССЛЕДОВАНИЯМ 1Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к способам подготовки биологических объектов к микроскопическим исследованиям.Известен способ подготовки биоло 5 гицеских объектов для изучения реакции их структур на действие криопротекторов с помощью электронной и оптицеской микроскопии заключающий 1 о ся в том, что перед фиксацией объекта из среды инкубирования удаляют криопротектор и используют Фиксатор в обыцной физиологицеской среде 1 1,15Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ подготовки биологических объектов к электронно микроскопическим исследованиям, 20 включающий их инкубацию в криопротекторе, отмывку буфером, фиксацию, обез воживание и заклюцение в отвердевающий материал 1 2 1. Недостатками способа являются разрув)ение цасти клеток при их отмы вании от криопротектора; изменение Формы клеток и других морфологическихпараметров, Зто связано с действиемдвух групп Факторов: остаточные явления после инкубации с криопротектором и его отмывки; осмотическиеявления при быстром (при медленном)удалении криопротектора из окружающей среды.Целью изобретения является сохранение морфологических признаков биологических объектов в процессе подготовки их к микроскопическим исследованиям,Поставленная цель достигается тем,что согласно способу подготовки биологических объектов к электронно-микроскопическим исследованиям, включающему их инкубацию в криопротекторе иотмывку буфером, фиксацию, обезвоживание и заключение в отвердевающийматериал предложено отмывку прово05 4ветствует ни предполагаемой реакции клеток на действие этиленгликоля высокой концентрации, ни их активному состоянию.По предложенному способу клетки в результате физико-химического воздействия приобретают сферическую фор. му,Следовательно, предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет устранить осмотически обусловленные артефакты препарирования и сохранить морфологические параметры объекта неизменными в течение всего процесса подготовки образца. Формула изобретения ром,40Для трансмиссионной электронноймикроскопии после отмывки осуществляют постфиксацию в растворе осмияго классичес.кой методике с последующим обезвоживанием в этаноле и45заключением в эпон.Для сравнения осуществляют обработку зритроцитов крови человекапредлагаемым способом и известным,По известному способу имеют место остаточные явления действия наэритроциты этиленгликоля и процессаотмывки, что влияет на степень сохра-ности клеток. Эритроциты приобретают промежуточную Форму между эхиноитами и дискоцитами, что не соотВНИИПИ Заказ 1 В 69/52 Т 3 1008дить ч 0"-ным раствором этиленгликоля в 0,1 М Фосфатном буфере, Фиксировать в 2".-ном растворе глутаральдегида на 0,1 М осфатном буфере, содержащем 0 г. этиленгликоля, далеевес-и промь вание в ряду растворов этиленгпиколя на 0,1 М Фосфатном буфере с нисходящей концентрацией 1 О/при изменении концентрации в каждомпоследующем растворе на 10 ь и отмыв- окой чистым 0,1 М фосфатным буфером,П р и и е р. Эритроциты после инкубирования с 104 этиленгликоля охлаждают до 0 С и отмывают от белков плазмы путем центрифугирования при 5000 об/мин,5 мин и замены среды инкубированияна ч 0;-ный раствор этиленгликоля в0,М фосфатном буфере,Отцентрифугированный осадок клеток заливают пятикратным объемом фик- осирующего раствора 22 ного глутаральдегида на 0,1 М фосфатном буфеое,содержащем 10 этиленгликоля, рН раствора 7,3, осмолярность по буферуо300, температура фиксации клетки 0в течение 1 ч отмывают в ряду растворов зтиленгликоля на 0,1 М фосфатном буфере нисходящей концентрацииОпри изменении концентрации вкаждом последующем растворе на 1 О;,Скор сть центрифугирования 1000 об/минВ чистом 01 М Фосфатном буфере клетки отмывают дважды.Для растровой электронной микроскопиии клетки обезвоживают в ряду35растворов этанола восходящей концентрации, после чего суспензию наносят на предметный столик, подсушивают и напыливают в вакууме серебСпссоб подготовки биологических объектов к электронно-микроскопическим исследованиям, включающий их инкубац:ю в криопротекторе, отмывку буфером, фиксацию, обезвоживание и заключение в отвердевающий материал, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью сохранения нативных морфологических признаков, отмывку проводят 0-ным раствором этиленгликоля в 0,1 М Фосфатном буфере, Фиксируют в 2 х-ном растворе глутаральдегида на 01 М фосфатном буФере, содержащем 10 этиленгликоля, далее ведут промывание в ряду раст воров этиленгликоля на 0,1 М фосфатном буфере с нисходящей концентрацией Опри изменении концентрации в каждом последующем растворе на 10 и отмывкой в чистом 0,1 М фосфатномбуфере. Источники информации,принятые во внимание при экспертизецепь Н, ТЬе 1 геег 1 п 9 сЬгевпо 1 арегрЬега 1 щосег пегез о 11 ои 1 п 9ргесгеас;ел с исЬ сесЬу вц 1 Гох 1 деапс есЬапо 1; ап е 1 ессгорЬув 1 о 1 о 9 с апсе 1 ессгоп щсгоьсор 1 с абсиду оп сЬевсас 1 с пегче гаЬЬ 1 св.- СгуоЬо 1 о 9 у "1977, 1 Й р.215-227,2. А 11 П 1 С.М, ТЬе еГГесс оГ сооп 9 Гасе апс сГпепспу5 ц 1 тохсе сопсепсгас 1 оп оп сЬе цсгавсгцссиге оГпеопаса гас Ьеагс се 11 в аГсег 1 геегп 9 апО сЬаиП 9; СгуоЬоо 9 у,1976, 13,Н 3, р305-316 (прототип).ираж Ь 71 Подписное