Способ дифференциации эпидемических и неэпидемических вибрионов вида vibrio eltor по типу иммунитета их умеренных фагов

СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЭПИДЕМИЧЕСКИХ И НЕЭПИДЕМИЧЕСКИХ ВИБРИОНОВ ВИДА VIBRIO ELTOR ПО ТИПУ ИММУНИТЕТА ИХ УМЕРЕННЫХ ФАГОВ, предусматривающий культивирование исследуемого штамма в присутствии индикаторных штаммов тест-культур с последующим определением эпидемичности или неэпидемичности по наличию фага в тест-культурах, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве тест-культур используют штаммы Vibrio eltor КМ-114 и КМ-117.

Изобретение относится к микробиологии, а именно к лабораторной диагностике.
Известен способ фаготипирования холерных вибрионов классического и эльтор биовара, включающий дифференциацию культур возбудителя холеры на фаготипы по способности переносимых ими фагов лизировать набор тест-культур (А. С. 822548 - аналог).
Эпидемические (или иначе vct⁺) вибрионы эльтор, вызывающие эпидемию холеры, являются носителями умеренных фагов только III иммунотипа и всегда монолизогенны, тогда как лизогенные культуры неэпидемических (иначе vct^-) вибрионов эльтор, не вызывающие эпидемию холеры в 95% случаев, несут умеренные фаги I, II, IV, Vl-XI иммунотипов в моно- и полилизогенных комбинациях, чем отличаются от vct+ штаммов того же биовара. И только 5% vct^- штаммов, подобно vct⁺ штаммам имеют профаг III иммунотипа. Фаги III иммунотипа vct^- вибрионов отличаются от гомоиммунных фагов vct⁺ штаммов по чувствительности тест-системы рестрикции-модификации РМ (А. С. N 1558987).
Для отличия большинства (95% ) vct^- вибрионов эльтор от vct⁺ вибрионов предложен способ дифференциации по типу иммунитета их умеренных фагов с помощью тест-системы (Караваева с соавт. , 1988, А. С. 1388423, 761560, 770187, 1454849, 1533311, 1596765, положительное решение по заявке N 46544141/13-028016 - прототип).
В основу способа положен принцип идентификации иммунотипа умеренного фага исследуемого штамма по характеру фагочувствительности одиннадцати тест-культур (табл. 1), лизогенных по умеренным фагам известных одиннадцати иммунотипов (I-XI): 485/41, 485/70, 485/222H, 485/132, 485/98, x, 570/611, 570/893, 570/583, 570/6901, 570/80, 485/1564 (соответственно). Каждая тест-культуры системы устойчива к гомоиммунным фагам и чувствительна к большинству гетероиммунных фагов (табл. ).
Недостатки этого метода следующие:
громоздкость. Для идентификации исследуемого штамма необходимо использовать 12 субкультур (11 перечисленных выше и универсально-чувствительный контрольный штамм 570 или 485);
применение тест-системы, включающей на сегодня 11 тест-культур, не исчерпывает всех возможных вариантов монолизогенных систем неэпидемических вибрионов, подлежащих отличию от эпидемических, и не пригодны для идентификации полилизогенных систем и потому недостаточно эффективно;
часть тест-культур получена на основе реципиентного штамма V. eltor 485 (в том числе 485/222Н), который отличается низкой генетической стабильностью и с высокой частотой (10^-2-10^-3) мутирует в фагорезистентную R-форму, что делает необходимым вести постоянную селекцию его S-вариантов - кропотливую работу, усложняющую этот способ.
Целью изобретения является упрощение способа дифференциации эпидемических (vct⁺) и неэпидемических (vct^-) вибрионов эльтор.
С целью упрощения известного способа в его основу положен иной принцип - дифференциация штаммов на 2 группы: относящиеся к III иммунотипу и не относящиеся к этому иммунотипу.
Цель достигается применением тест-систем из двух тест-культур вместо 12 указанных ранее: V. eltor 570 (депонированный под номером КМ-114) - контрольный штамм, чувствительный к холерным умеренным фагам всех известных иммунотипов и его субкультур V. eltor 570/222H (депонированный под номером КМ-117), экспериментально лизогенизированную фагом III иммунотипа и вследствие этого обладающую специфической устойчивостью к литическому действию фагов III иммунотипа и чувствительностью исходного штамм 570 к фагам других иммунотипов.
Умеренные фаги любого, но не III иммунотипа в моно- и полилизогенной системе vct- вибрионов лизируют при совместном культивировании обе субкультуры (570 и 570/222Н). Умеренные фаги III иммунотипа, носителями которых являются 100% эпидемических (vct⁺) вибрионов и 5% неэпидемических (vct^-) вибрионов, лизируют только субкультуру 570 и не лизируют субкультур 570/222Н.
При выделении штамма V. eltor, несущего фаг III иммунотипа при плановых обследованиях водоемов на холеру, он расценивается как подозрительный на принадлежность к эпидемическим. Окончательное заключение делается, как указано выше, с помощью системы РМ.
При выделении V. eltor, несущего фаг любого другого иммунотипа в моно- и полилизогенной системе, он идентифицируется как неэпидемический.
Замена тест-системы прототипа на предлагаемую помимо повышения эффективности метода за счет ее более широкого спектра специфической чувствительности дает значительный экономический эффект: сокращаются затраты 1% агара Мартена на 500 мл, 0,7% агара Мартена на 60 мл и рабочего времени в 6 раз.
Отличительным признаком штаммов 570 и 570/222H от штаммов 485 и 485/222H является генетическая стабильность при культивировании и хранении на искусственных питательных средах. Они с низкой частотой (10^-6-10^-7) мутируют в R-форму. Их применение упрощает способ, исключая необходимость селекции гладкого варианта на RO-сыворотке.
Культурально-морфологические признаки штаммов 570 и 570/222Н. Подвижные, слегка изогнутые палочки с одним полярно расположенным жгутиком, спор и капсул не образуют, грамотрицательны.
На твердых питательных средах (агар Мартена, агар Хоттингера рН 7,6 0,2) через 18 ч выращивания при 37 1^оС образуют круглые с ровным краем диаметром 3,0 0,5 мм прозрачные колонии с голубоватым оттенком.
На жидких питательных средах (бульон Мартена, 1% пептонная вода, бульон Хоттингера рН 7,8 0,2) через 6 ч выращивания при 37 1^оС образуют равномерную муть и нежную пленку на поверхности.
Физиологические признаки. Тест на оксидазу положителен, разлагает до кислоты без газа маннозу, глюкозу, сахарозу, маннит, не разлагают арабинозу, инозит, лактозу, ферментируют и окисляют глюкозу в среде Хью-Лейфсона, ферментируют крахмал, желатину, не образуют дегидролазу аргинина, образуют декарбоксилазы лизина и орнитина, не растут при повышенной (7-10% ) концентрации хлорида натрия, агглютигируют куриные эритроциты, не чувствительны к полимиксину.
Серологические свойства. Агглютинируются до титра холерными сыворотками 0 и Огава, не агглютинируются холерными сыворотками RO и Инаба.
Размножают штаммы 570 и 570/222Н на бульоне и агаре Мартена рН 7,6 0,3, хранят в лиофилизированном состоянии.
П р и м е р. Полную петлю суточной агаровой культуры исследуемого штамма наносят уколом на 1% агаровую пластинку (агар Мартена рН 7,2). Полученные макроколонии заливают 3 мл 0,7% -ного полужидкого агара Мартена (рН 7,2), куда добавляют предварительно 0,4-0,5 мл 1 млрд. взвеси агаровой культуры индикаторного штамма V. eltor 570 в физ. растворе (рН 7,2).
Через сутки инкубирования посевов при 37^оС из зоны фагового лизиса вокруг макроколоний скальпелем вырезают 1 см² верхнего слоя агара, его эмульсируют в 5 мл пептонной воды и дают осесть агару. Верхний слой отстоя (1,5-2 мл) отсасывают и готовят десятикратные разведения до 10⁴. Разведения до 10^-2-10^-4 наносят калиброванной (5 мм) петлей на газон индикаторных штаммов 570 и 570/222Н. Газон готовят из суточной агаровой культуры как указано выше. Учет результатов проводят через 18-20 ч инкубирования при 37^оС. При наличии фага в контроле (570) и опыте (570/222) исследуемый штамм относят к неэпидемическим (vct^-). При наличии фага в контроле (на штамме 570) и его отсутствии на штамме 570/222Н исследуемую культуру предварительно относят к эпидемическим. Окончательное заключение о принадлежности штамма к неэпидемическим (vct^-) или эпидемическим (vct⁺) делают после его исследования с помощью системы РМ (А. С. 1558987).
Применение способа в практике противоэпидемической службы облегчит задачу эпидемиологических исследований при алановых обследованиях водоемов территорий, угрожаемых по холере, и повысит их качество, явится основанием дифференцированного подхода к определению объема профилактических и противоэпидемических мероприятий. (56) Авторское свидетельство СССР N 822548, кл. С 12 N 1/20, 1983.
Авторское свидетельство СССР N 1388423, кл. С 12 N 1/20,1988.
Авторское свидетельство СССР N 1454849, кл. С 12 N 1/20, 1989.
Авторское свидетельство СССР N 1596765, кл. С 12 N 1/20, 1989.
Использование: микробиология, эпидемиология, диагностика. Сущность изобретения: применение в качестве тест-системы двух культур Vibrio eltor 570 /КМ - 114/ и 570/222Н/КМ - 117/. Штамм КМ - 114 чувствителен к холерным умеренным фагам всех известных иммунотипов, а его субкультура штамм КМ-117 обладает устойчивостью к литическому действию фагов III иммунотипа. При выявлении с помощью данной тест-системы штаммов V. eltor, несущих фаг III иммунотипа, они расцениваются как подозрительные на принадлежность к эпидемическим. Использование данной тест-системы упрощает первичную скрипинг-диагностику V. eltor.