Способ получения инозина

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНОЗИНА, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма Bacillus subtilis в регулируемых условиях аэрации и поддержания рH среды подачей источника азота на питательной среде в присутствии глюкозы и БВКс последующим отделением полученной биомассы, выделением и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода, удешевления процесса за счет снижения расхода глюкозы и упрощения выделения и очистки, культивирование ведут на питательной среде, дополнительно содержащей азотнокислый аммоний и сернокислый магний, в качестве источника азота используют аммиачную воду, а глюкозу подают в процессе культивирования дробно в виде 50%-ного раствора из расчета достижения концентрации ее в среде 0,05 - 0,9%.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения инозина (рибоксина) методом микробиологического синтеза. С целью повышения выхода инозина, удешевления процесса за счет снижения расхода глюкозы и упрощения выделения и очистки, культивирование ведут на питательной среде, содержащей белково-витаминный концентрат (БВК), азотнокислый аммоний и сернокислый магний, в качестве источника азота используют аммиачную воду, а глюкозу в процессе культивирования дробно из расчета достижения концентрации ее в среде 0,05-0,9%. Использование такого способа позволяет увеличить съем инозина с аппарата, снизить расход глюкозы на единицу продукции, упростить процесс выделения и очистки и повысить производительность процесса биосинтеза.
Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения инозина (рибоксина) методом микробиологического синтеза.
Целью изобретения является увеличение выхода инозина, удешевление процесса за счет снижения расхода глюкозы и упрощения выделения и очистки.
Способ получения инозина осуществляют путем культивирования Bacillus subtilis ВНИИгенетика 72 в регулируемых условиях аэрации на среде, содержащей БВК, соли аммония и магния. В качестве источника азота используют аммиачную воду, которую подают автоматически в соответствии с заданным уровнем рН (6,5-6,7). Глюкозу добавляют в процессе культивирования дробно из расчета достижения ее концентрации в среде 0,05-0,9%.
П р и м е р 1. Односуточную культуру штамма В. sibtillis ВНИИгенетика 72 переносят в колбы, содержащие посевную среду следующего состава, (мас.% ): глюкоза - 2,0. БВК - 2,0, NaCl - 0,25. Посевной материал выращивают на качалке, делающей 220-240 об/мин при температуре 34^оС в течение 18 ч. Затем посевной материал в количестве 2 об.% переносят в ферментер емкостью 1,2 л содержащий 700 л ферментационной среды следующего состава (мас.%): БВК 2,0; NH₄NO₃ - 0,5; MgSO₄ - 0,5. Культивирование осуществляют в аппаратах емкостью 1,2 л в течение 86 ч при 34^оС, скорости перемешивания 750 об/мин, скорости подачи воздуха 0,7 л/мин. В процессе культивирования раствор глюкозы (50% -ный) добавляют в среду с постоянной скоростью 1,3 г/л, что обеспечивает содержание глюкозы в культуральной жидкости на уровне 0,15%, а источник азота - аммиачную воду (25%) подают в среду автоматически в соответствии с заданным уровнем рН 6,0. При этом накопление инозина составляет 18,4 г/л, а съем с аппарата 13,7 г, расход глюкозы 6,1 г/г.
1 л культуральной жидкости с концентрацией инозина 28 г/л прогревают 10 мин при 90^оС, вносят 3 г перлита при перемешивании и затем ведут фильтрацию при 60-70^оС через бумажный фильтр на воронке Бюхнера.
Полученный раствор вторично фильтруют на той же воронке, но через угольную "подушку" (масса угля 9 г).
После отделения биомассы и осветления на угле объем нативного раствора составляет 940 мл имеет следующие характеристики: СВ 6%, рН 5,9 сумма неорганических катионов 135 мг-экв/л, цветность 0,212 ( = 530 нм), содержание гипоксантина 0,05 г/л, гуанозина 0,5 г/л, гуанина 0,08 г/л. Нативный раствор упаривают на роторном испарителе до объема 400 мл и ведут кристаллизацию при 6-8^оС в течение 5 ч, затем кристаллы отделяют на фильтре. Объем маточного раствора 350 мл концентрация инозина 8 г/л.
Полученные кристаллы растворяют в воде при 65-790^оС и фильтруют через угольную "подушку" на воронке Бюхнера и затем сушат в сушильном шкафу при 60-70^оС. Получено 20 г инозина, общий выход составляет 71,5% без утилизации маточных растворов. После утилизации маточных растворов выход готового продукта повышается на 90% по отношению к исходной концентрации инозина в культуральной жидкости.
Полученный препарат соответствует требованиям, предъявляемым к медицинскому препарату.
П р и м е р ы 2-5. Процесс осуществляется также, как описано в примере 1, но ведут при рН 6,5, 6,7, 7,2 и 7,5 соответственно.
Результаты примеров с 1 по 5 приведены в табл. 1.
Наилучшие результаты, как видно из табл. 1, достигнуты при поддержании рН на протяжении всей ферментации на уровне 6,5-6,7.
П р и м е р ы 6-12. Процесс осуществляют, как в примере 1, но ведут при рН 6,7 и с разной скоростью подачи глюкозы, обеспечивающей содержание глюкозы в культуральной жидкости от 0,03% в примере 6 до 1,2% в примере 12. Результаты этих примеров в сравнении с известным способом без пробной подачи глюкозы (прототип) приведены в таблице 2.
Как видно из табл. 2, при ведении процесса с подпиткой съем инозина с аппарата выше, а расход глюкозы на единицу продукта ниже, чем при ведении процесса по известному способу, без дробной подачи глюкозы. Наилучшие результаты по всем технологическим показателям (накопление инозина, съем с аппарата, расход глюкозы) достигнуты при поддержании глюкозы в среде на уровне 0,05-0,9%.
П р и м е р 13. Суспензию клеток штамма В. subtillis ВНИИгенетика 72, смытых физраствором с 2 матрацев Хоттингера после 24 ч выращивания при 34^оС, используют для засева посевного аппарата объемом 2 м³, содержащего 600 л посевной среды следующего состава, мас.%: глюкоза 2,0; БВК 2,0; NaCl 0,25. Выращивание посевного материала осуществляют при температуре 34^оС, аэрации 36 м³/в течение 16 ч. Затем посевной материал в количестве 300 л передают в ферментер объемом 15 м³ (рабочий объем 7 м³), содержащий ферментационную среду следующего состава, мас.%: БВК 2,0; азотнокислый аммоний 0,5; сернокислый магний 0,5, рН 6,7. Питательную среду стерилизуют через УНС при 135-138^о. Ферментацию осуществляют при следующих параметрах: температура 34 1^о, аэрация - первые 10 ч 600 м³/ч, затем 800 м³/ч при постоянном перемешивании, рН поддерживают на уровне 6,7 автоматической подачей 25% -ной аммиачной воды. Раствор глюкозы дл подпитки готовят и стерилизуют отдельно (концентрация 50%) и подают в рабочий ферментер.
Скорость подачи раствора глюкозы регулируют автоматически индукционным расходомером. Такой способ подачи глюкозы с переменной скоростью обеспечивает оптимальное ее содержание в среде в пределах от 0,05 до 0,9%.
После 79 ч ферментации в культуральной жидкости накапливается 20,1 г/л инозина. Расход глюкозы на 1 кг инозина составляет 5,2 кг.
В табл. 3 приведены данные по сравнению технологических показателей процесса с подпиткой (пример 13) и известного процесса (без дробной подачи глюкозы), полученные в производственных условиях (аппараты 15 и 16 м³).
Как видно из табл. 3, в предлагаемом способе показатели по съему инозина с аппарата и производительность процесса выше, а расход глюкозы на 1 кг инозина ниже, чем в известном способе.
Таким образом, использование способа позволяет повысить съем инозина с аппарата, снизить расход глюкозы на единицу продукции, значительно упростить технологическую схему выделения за счет уменьшения содержания суммы катионов и остаточных сахаров в культуральной жидкости. Способ позволяет увеличить выход инозина на стадии выделения до 70-90%.
Сущность изобретения: односуточную культуру штамма Bacillus subtilis ВНИИгенетика 72, выращенную на косяке Хоттингера, переносят в колбы с посевной средой, содержащей глюкозу, белково-витаминный концентрат (БВК), хлористый натрий. Посевной материал выращивают 12 - 24 ч при 28 - 37°С в условиях аэрации и передают в ферментационную среду в количестве 1 - 10%. Ферментационная среда содержит БВК, соли аммония и магния, не содержит источников углерода. Ферментацию осуществляют при 28 - 34°С и при перемешивании и аэрации в режиме подпитки источником углерода, в частности раствором глюкозы, который подают в рабочий аппарат периодически таким образом, чтобы ее концентрация в среде составляла 0,05 - 0,9%. Содержание глюкозы в среде в течение всего периода ферментации контролируют глюкозооксидантным методом. В качестве источника азота используют аммонийную воду, которую подают в рабочий аппарат автоматически в соответствии с заданным уровнем 6,5 - 6,7. Выделение инозина осуществляют по схеме, включающей следующие основные стадии: отделение биомассы, осветление нативного раствора, концентрирование, кристаллизация, сушка готового продукта. Выход инозина повышается в 1,5 - 2 раза, эффективность переработки глюкозы повышается в 2 раза. Упрощается выделение и очистка целевого продукта. 2 табл.