Способ получения антигенного препарата для определения антинуклеарного фактора

Способ получения антигенного препарата для определения антинуклеарного фактора путем обработки ткани печени экспериментальных животных, отличающийся тем, что, с целью повышения антигенной активности препарата, обработку ткани печени проводят путем ультразвуковой дезинтеграции, концентрирования, внесения в концентрат компонентов полимеризации полиакриламида, а также магнитного материала в виде окиси железа, полимеризации смеси и получения антигенного материала в виде гранул с последующим их отмыванием и консервацией для хранения перед использованием в реакции иммунофлюоресцентного выявления антинуклеарного фактора.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунодиагностике и может найти применение в биотехнологии.
Наиболее близким к предлагаемому способу является способ определения АНФ иммунофлюоресцентным методом с использованием срезов печени лабораторных животных.
Однако этот метод имеет ряд ограничений приготовление препаратов и оценка результатов занимает 48 ч, для постановки реакции требуется свежеприготовленные гистологические срезы печени белых крыс, применение этого метода затруднительно при массовом обследовании населения и отличается субъективной оценкой результатов.
Cерьезным недостатком традиционного метода является однократность применения гистологических срезов и то, что в реакции непрямой иммунофлюоресценции участвуют только поверхностные клеточные антигены. Применение ультразвукового дезинтеграта печени крысы с последующей его иммобилизацией в ПААГ позволяет освободить глубоколежащие антигенные структуры и использовать его в реакции непрямой иммунофлюоресценции.
Целью изобретения является повышение антигенной активности препарата.
Цель достигается за счет замены срезов печени лабораторных животных препаратом иммобилизированного гранулированного ядерного материала с магнитными свойствами, который получают путем включения ультразвукового дезинтеграта печени белой крысы в структуру полиакриламидного геля, что позволяет прочно фиксировать биополимеры, стабилизировать их с сохранением биологических свойств. Полученный носитель инертен, устойчив к физико-химическому и биологическому воздействию, что позволяет длительно его хранить. Получение гранулированного препарата осуществляется в потоке газообразного азота за счет создания эмульсии вода в масле с включением магнитного материала окиси железа размером частиц 0,05 -5 мкм. Использование одной партии гранул препарата со стандартной сферической формой и включенным магнитным материалом стандартизирует результаты исследования, облегчает манипуляции с ними. Получение препарата с иммобилизированным ядерным матеpиалом для определения АНФ и постановка реакции иммунофлюоресценции с ним поясняется следующими примерами.
П р и м е р 1. Получение ультразвукового дезинтеграта.
Ультразвуковой дезинтеграт ткани печени белой крысы, содержащий весь комплекс ядерных антигенов, получали на приборе МСЕ при 20 кГц и Т=-4^oC. После чего его концентрировали в 4 раза через полунепроницаемую мембрану N 3400 фирмы под действием разряжения, создаваемого вакуумным насосом.
П р и м е р 2. Иммобилизация комплексного ядерного материала в структуру пааг.
В 2 мл водорастворимого комплексного ядерного материала растворяли соответственно 100 и 300 мг метиленбисакриламида и акриламида. В сосуд, содержащий 100 мл гексана и 0,5 мл СПЕН-85, подавали под давлением 0,2-1 атм газообразный азот по трубке сечением 0,8 мм таким образом, чтобы создать интенсивное перемешивание в течение 5 мин.
В колбу для полимеризации вносили в 1 мл ЭФР 200 мг окиси железа с гидрофильными свойствами и 10 мг персульфата аммония и через 1-2 мин добавляли 2 мл дезинтеграта с растворенными мономерами и 20 мкл тетраметилендиамина (ТЭМЭД). После завершения полимеризации в течение 10-15 мин гранулы отмывали ацетоном и ЭФР с твином-20 (0,5%) 3-5 раз инкубировали 30 мин в 1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина для исключения неспецифического взаимодействия во время постановки реакции. Полученные гранулы имели стандартную сферическую форму с размерами 10-100 мкм, препарат хранили в ЭФР с 0,01% формалина. Из полученных гранул готовится 10% взвесь. Постановку реакции осуществляли в пробирках или в планшетах из расчета 20 мкл 10% взвеси гранул на одну пробу.
П р и м е р 3. Постановка реакции иммунофлюоресценции на иммобилизированном гранулированном антигенном препарате для определения АНФ. Для отмывки от консерванта в лунку планшета вносили 0,5 мл ЭФР и добавляли 20 мкл 10% гранул, ЭФР отсасывали и затем вносили 0,1 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:10 и инкубировали в течение 30 мин при Т=+37^oC. После этого сыворотку удалили и гранулы трижды промывали ЭФР с твином-20 (0,05%) и трижды простым ЭФР. Выявление специфических антител осуществляли коммерческой видовой люминесцирующей сывороткой. После инкубации 30 мин при +37^oC гранулы отмывали в последовательности, описанной выше. Выявление уровня свечения микрогранул осуществляли с помощью люминесцентного микроскопа снабженного фотометрической приставкой ФМЭЛ-1А. К насадке подключали источник тока УБПВ-1 и цифровой вольтметр Щ-430. Работу проводили при напряжении 1800 В, светофильтры возбуждающего света СЭС 24-4, СС 15-4, интерференционный светофильтр фотометрической насадки (мах=525 НМ). Увеличение объектива 90% окуляра (х⁵). Предметное стекло с фиксированными на нем гранулами устанавливали на столике микроскопа и находили их в поле зрения объектива. Выбранный зонд (0,5) фотометрической насадки совмещали с фотометрируемым участком гранулы и при максимально закрытой полевой диафрагме снимали цифровое значение флюоресценции гранул на вольтметре. Высчитывали среднее значение свечения 6 гранул, а также среднее значение флюоресценции фона. Разница свечения гранул и фона выражается в относительных единицах флюоресценции (мВ) и характеризует свечение препарата. Положительной считают интенсивность флюоресценции гранул, достоверно отличающуюся от интенсивности контрольных препаратов. При отсутствии фотометрической насадки интенсивность свечения можно измерять классическим методом по 4-бальной системе.
П р и м е р 4. Определение чувствительности препарата.
Для доказательства чувствительности препарата ставили реакцию иммунофлюоресценции с использованием 40 сывороток больных СКВ. Традиционным методом (на срезах печени белой крысы) АНФ выявлен у 31 человека, в то время как на иммобилизированном ядерном препарате АНФ выявлен в 100% случаев (40 человек), причем титр АНФ на срезах в основном колебался от 1:5-1:80, в 5% - от 1: 160-1: 320, в то время как на иммобилизированном гранулированном ядерном материале в 98% титр составлял от 1:80-1:640, a 2% 1:1280.
Чувствительность повышается за счет увеличения концентрации антигена в иммобилизированном препарате (повышение концентрации антигена в 4 раза, увеличивает чувствительность в 8 раз).
П р и м е р 5. Определение специфичности препарата.
Специфичность препарата проверяли следующим образом: после обработки сывороткой больного иммобилизированный гранулированный антигенный препарат обрабатывали иммунной флюоресцирующей нормальной сывороткой специфического свечения не отмечалось; после обработки препарата сывороткой донора с последующей окраской флюоресцирующей сывороткой против иммуноглобулинов человека специфического свечения не отмечалось; иммубилизированный гранулированный ядерный материал обрабатывали сывороткой больного (заведомо положительной), а затем соответствующей кроличьей против иммуноглобулинов человека сывороткой неокрашенной ФИТЦ, после промывания препарата снова обрабатывали гомологичной, но уже флюоресцирующей антиантисывороткой - отмечали слабое специфическое свечение; введен дополнительный контрольный тест: заведомо положительную сыворотку адсорбировали антигеном (печеночным порошком), затем работу данной сыворотки проверяли на гранулах и срезах - специфического свечения нет.
Таким образом, предложенный метод не уступает по точности и специфичности известному, а по чувствительности превосходит традиционный в 8 раз.
П р и м е р 6. Определение АНФ у больных СКВ.
Постановка реакции иммунофлюоресценции проводится по методике описанной в примере 2, в качестве исследуемой использовалась сыворотка больных СКВ. Для контроля применяли гранулы обработанные: донорской сывороткой в разведении 1:10; видовой специфической люминесцирующей сывороткой в рабочем разведении.
Уровень флюоресценции контрольных препаратов составили 3-10 МВ интенсивность специфического изумрудно-зеленого свечения гранул, обработанных сывороткой больных СКВ от 20 мВ и выше. АНФ выявлен в 9% случаев, что коррелирует с данными литературы.
П р и м е р 7. Определение АНФ у больных ревматоидным артритом.
Постановка реакции иммунофлюоресценции проводится по методике описанной в примере 2, в качестве исследуемой использовалась сыворотка больных РА. Для контроля применяли гранулы обработанные:
донорской сывороткой в разведении 1:10;
видовой специфической люминесцирующей сывороткой в рабочем разведении.
Уровень флюоресценции контрольных препаратов составил 3-10 мВ, интенсивность изумрудно-зеленого свечения гранул, обработанных сывороткой больных РА 20 и выше. АНФ выявлен в 33% случаев, что коррелирует с данными литературы.
П р и м е р 8. Определение АНФ у больных ССД.
Постановка реакции ИФ проводится по методике, описанной в примере 2, в качестве исследуемой используется сыворотка больных ССД. Для контроля применяли гранулы обработанные:
донорской сывороткой в разведении 1:10;
видовой специфической люминесцирующей сывороткой в рабочем разведении. Уровень флюоресценции контрольных препаратов составил 3-10 мВ, интенсивность специфического изумрудно-зеленого свечения гранул, обработанных сывороткой больных ССД от 20 и выше. АНФ выявлен в 80% случаев, что коррелирует с данными литературы.
П р и м е р 9. Регенерация иммобилизированного антигенного препарата.
Регенерацию гранулированного ядерного материала с магнитными свойствами проводят раствором ЗМ N aCN или 0,1 М глицин-НСl буфером (рН 2,2) в режиме - на 1 г сорбента 2 мл десорбирующего раствора обработка в течение 1 ч с последующей отмывкой до нейтрального значения рН или до полного отсутствия ионов CN при температуре +20-25^oC.
Используемая молярность и рH буферов получена экспериментальным путем при создании линейных градиентов молярности и концентрации водородных ионов, что позволило полностью и одномоментно десорбировать все фиксированные на носителе специфические иммуноглобулины.
Иммобилизация ядерного материала в трехмерную структуру полиакриламидного геля дает стабилизацию материала, позволяет длительно его хранить (1-2 года) и неоднократно использовать (более 10 раз) после предварительной десорбции.
Использование метода эмульсионной полимеризации полиакриламидного геля позволяет получить дешевый и технологически удобный препарат для определения антинуклеарного фактора.
Изобретение относится к медицине. Оно позволяет проводить определение АНФ в сыворотках крови больных ревматическими заболеваниями с помощью иммобилизированного гранулированного ядерного материала. Цель изобретения - повышение антигенной активности препарата. Для достижения цели ультразвуковой дезинтеграт и магнитный материал иммобилизировали методом эмульсионного гранулированного в трехмерную решетку полиакриламидного геля. Методом определения АНФ служила реакция непрямой иммунофлюоресценции. Изобретение позволяет за счет повышения активности препарата повысить чувствительность определения антинуклеарного фактора в 8 раз.