Способ консервирования спермы животных

.ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик рц 986411. но делам изобретений и открытийДата опубликования описания 07.01.83(54) СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ СПЕРМЫ ЖИВОТНЫХ Изобретение относится к области искусственного осеменения сельскохозяйственных животных, в частности к способам консервирования спермы дутем замораживания. Известен способ консервирования спермы животных в пайетах, включающий разбавление спермы до половины конечной стадии разбавления защитной средой, содержащей 3 глицерина, охлаждение разбавленного семени до +4 оС за 45-60 мин, вторичное разбавление семени защитной средой, содержащей 11 глицерина, расфасовку, .в соломинки, эквилибрацию и, наконец, замораживание его с последующим оттаиванием (1).Недостатком этого способа является быстрое охлаждение семени до +4 оС, отрицательное влияние высокой концентрации глицерина и длительного времени контакта с ним живчиков, которое проявляется в нарушении апикального края акросомы, разрушении устойчивости белково-липоидных комплексов, а после замораживания и оттаивания семени быков-производителей снижается подвижность живчиков и абсолютный показатель их живучести. Кроме того, при длительном контакте живчиков с глицерином имеет место утечка ряда ферментов, аминокислот, жирных кислот и функциональных групп из клеток сперматозоидов в плазму что ведет к снижению биоло"lгической полноценности спермы.Известен также способ консервирования сперьк животных, включающий ее разбавление на первом этапе безглицериновой защитной средой, а на втором этапе - защитной. средой с глицерином. При этом охлаждение проводят в течение 2 ч от 30 до 40 фС; а замораживание проводят при -80 оС 2. Однако длительный контакт (более30 мин) живчиков с глицерином приводит к нарушению устойчивости белково-липидных комплексов, морфологическим изменением акросоьы, выходу вплазму из живчиков ферментов,В результате этого значительноснижается активность живчиков послеоттаивания и составляет примерно 22,5 балла.Целью изобретения является повышение жизнеспособности и биологической полноценносаи сперматозоидовпосле замораживания и оттаивания,986411 Таблица 1 Режимы охлаждения семени Температурный и временной режимы Режимы охлаждения 2 от +30 до +15 С от +15 до +10 С 0,2 0,5 0,4 0,3 0,4 0,3 0,2 0,2 от +10 до -4 СВремя охлаждения семенидо +4 С, мин 0,3 0,2 0,1 0,1 63 85 160 135 Цель достигается тем, что охлаждение спермы проводят от +30 до+15 фС со скоростью 0,4-0,5 С/минот +15 до +10 С со скоростью 0,30,4 С/мин и от. +106 до +4 фС со скоростью 0,2-0,3 С/мин, эквилибрациюс глицерином проводят при +4-+5 Стечение 25-30 мин, а замораживаниеспермы проводят в парах жидкого азота при температуре -120"-140 С втечение 8-8,5 мин.10П р и м е р. Технология приготовления и консервирования семени сельскохозяйственных животных заключается в следующем. Вначале готовят защитную среду для разбавления семени.Для приготовления используют лактозу, Фруктозу, рафинозу, сульфат магния, куриный желток и спермосан-З.Разбавление семени вышеуказаннойсредой проводят на половину конечной степени разбавления: температурасреды в момент разбавления +30 С.Баночки с разбавленной спермойпомещают в ванночки с водой, темпе-,ратура которой +30 С, и переносят вхолодильную витрину с постоянной температурой +4 С,Охлаждение семени проводят трехступенчато: от +30 до +15 С, от +15до +10 С и от +10 до +4 С. Охлаждение проводят путем добавления кусочков тающего льда или воды комнатнойтемпературы.При проведении опыта взято несколь ко режимов охлаждения и изучено ихвлияние на биохимические и физиоло 63гические показатели живчиков послезамораживания и оттаивания семени(см табл, 1)Установлено, что оптимальным режимом охлаждения является режим 3. 40После охлаждения и выдержки семени при +4 С в течение 3,0-3,5 чсперму разбавляют вторично той жезащитной средой, но содержащей дОполнительно 10 мл глицерина на 100 мл. 45дистиллированной воды,Температура среды в момент дополнительного разбавления равна +4 С. После второго разбавления семенилактозо-фруктово-магниево-желточнойсредой, содержащей дополнительноглицерин, проводят расфасовку семени вручную или автоматически в полимерные соломинки объемом 0,5 мл,выдерживают их в витрине холодильника в течение 30 мин, после чего семя сразу замораживают.Замораживание проводят в широкогорлом сосуде Дьюара, для чего соломинки раскладывают горизонтальнона специальной рампе и помещают еенад парами жидкого азота на уровне3-4 см от уровня азота при следующихтемпературах (см. табл. 2).Время замораживания составляет .8 мин.Температуру замораживания семениконтролируют термопарой и регулируют расстоянием от уровня жидкого азота до рампы, где горизонтально былирасположены соломинки с семенем.(Время выдержки семени в парахжидкого азота составляет 8 мин, после чего соломинки опускают в жидкийазот, где их карантируют в течение30 дней, а затем переводят в спермобанк для дальнейшей отправки в хозяйства,В результате контакта семени сглицерином в течение 30 мин улучшаются биохимические и физиологическиепоказатели живчиков, в частности такие, как подвижность живчиков и продолжительность их жизни после оттаивания (см. табл. 3).При предложенном режиме охлаждения достигается стабилизация морфологическнх, биохимических и физиологических показателей семени (см.табл. 4) .Данные показатели характеризуютсемя до его замораживания.В табл. 5 приведены качественныепоказатели семени быков-производителей после оттаивания.Предложенный способ позволяетулучшить качество оттаянной спермы,повысить оплодотворяемость животныхпри снижении количества доз семени.9864 Ы Та блица 2Влияние различных режимов замораживания семени быков-производителейна подвижность и продолжительность жизни живчиков после оттаивания Температура замораживания, 0 С Показатель Опыт, 9 1 -120 4,6+0,21 8,.8+0,2 ф 8,8+0,2 9,0+0,3 ф 4,6+0,18 4,6+0,21 42+0,35 7,6+0,5 ф -различия статистически достоверны по отношению к прототипу,2 -130 3 -140 4 -160 подвижность . продолжительность живчиков по- жизни живчиков после оттаива" сле оттаивания при ния, баллы 37 фС, дии абсолютный показатель живучестиживчиков при+ +1 СО СО фФГ 1 Л%Р Ф3ьо,о4 +1С 3 ГЪсФ с 3 о 4.1 Л Г 4 ь с с о + м тР Г 3 Ль Л о+1 Ю Л + Г 4 Р 1 сУ сР Г 4 Л ьо о + +1 Л Г 4 Г 4 сР 3 Л Ю +1 с фР Г 4ь о о + +1 3 Г 4с сУ е 3 Л Ю 4 Г 4 ь 51 Р ь Ю +1 Р с Ф ьход ",и оао мд Ц6 Д ЯО 6 6 М6 3 Я М Йа 6 о вЛ 1 1 1 3 с 3 а ц ц ы Ж 6 ж я а х у ц ц ж ЯЖ э 66 О Ж 1 Ц Р,В Р д 3 34 д о ц д 6 О Д о ЖМИ ж ж О сд дед оаэи И: Р 6 С 1 с, д а) ое д В 36 Х х Ыо 63 Г,Е Ы 6 Р ц 6 ж о х ц М Р 6 Д ж ц х 6 О 2 о в х Р ц Д 6 р 6 М д 6 3 3 ж ж СС,Ц986411 Таблица 4 Морфологические, бибхимические и физиологические показатели семени до замораживания Предложенный способ Патент Великобританииохлаждения семенив 1479648 Показатель 22 И 6, 7 ф 203+5 у 8 2022+15,269011,3 2195+17,275+1,5 184+2,87,510,06 16142,58 фООе 08 Подвижность живчиков ХХ-Рс О, 01 у Х -Рс 0,05. Та блица 5 Результаты испытания предложенного способа ниэкотемпературного замораживания с применением ЛФРМГЖ среды Опыт, Е Предлагаемюй . способ Показатель Подвижность живчиков после оттаиванйя 4,75+0,09 Продолжительность жизни живчиков после оттаивания при 37 С, ч 8,810,34 Абсолютный показатель живучести живчиков после оттаивания при 37 С 30,2+1,2 Продолжительность жизни живчиковпосле оттаивания при +2-+4 С,212,0+7,3 Абсолютный показатель живучести живчиков после оттаивания при +2-+4 фС 602,6115,4 Состояние акросомы,живчиков г нормальной разрушенной 61,511,2 38,5+1,2 Устойчивость белково-холестериновых комплексов, мкг холестеринана 10 живчиков 185 Оплодотворяемость коров от первого осеменения 67,5,60 Формула изобретения Способ консервирования сперьи животных, включающий ее разбавление беэглицериновой защитной средой, охлаждение, повторное разбавление спер Устойчивость белково-хслестериновых комплексов,мкг холестерина на 10 вживчиковУстойчивость белково-фосфолипидных комплексов, мкгдфосфолипидовФ живчиков с нормальнойакросомойАктивность глутаминоаспаргиновой трансаминазы в плазме семени ьи защитной средой, содержащий глицерин,эквилибрацию с глицерином и замораживание,о т л и ч а ю щ н й с я тем, что, с целью повьааения жиэкеспособности и биологической полноценности спермотозоидов псле замораживания986411 Составитель А. ФилипповаРедактор О, Юркова Техред С. Мигунова Корректор И. Ватрушкина тираж 7.1 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Заказ 10363/6 филиал ППП 1 Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 и оттаивания, охлаждение спермы проводят от +30 до +15 С со скоростью0,4-0,5 С/мин, от +15 до +10 ОС соскоростью 0,3-0,4 С/мин и от +10до +4 фС со скоростью 0,2-0,3 С/мин,зквилибрацию с глицерином проводятпри +4-.+5 ОС в течение 25"30 мин, азамораживание спермы проводят в па 1 рах жидкого азота при температуре-120 в 140 в течение 8-8,5 мин.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, ХЬе РгепсЬ 81 гам есЬп 1 ццХ,1976.2. Патент Великобритании Н 1479648,кл, А 01 0 1/202, 1977 (прототип) .