Способ приготовления серийных разведений для микротитрования

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихРеслублик оц 951138(51 М. Кл.з с присоединением заявки МоС 01 И 33/48 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий;,"( 0 о-исследовательский инс гии и микробиологии вский н эпидем 71 Заявитель ИГОТОВЛЕНИЯ СЕРИИНЫХ РАЗВЕДЕНИ ДЛЯ МИКРОТИТРОВАНИЯ 4) СПОСО Изобретение относится к биологйи и медицине, в частности к микробиологии, иммунологии и вирусологии, и может быть использовано при серо- логических исследованиях, например для постановки реакции агглютинации или других тестов при титровании различных, биологических жидкостей всерийных разведениях. ф 10Йзвестен способ приготовления серийных разведений для микротитровайия с помощью специальных .устройств - микротитраторов. Такие устройства имеют: титровальную пЛастину с ячейками в виде расположенных рядами углублений, дозировочную пипетку с капельной насадкой и приспособление для разбавления титруемой жидкости. Приспособление для разбавления жидкости выполнено в виде рубашки из термостойкой пластинки, охваты-. вающей с соблюдением .зазора конец металлического стержня, и образующей по существу определенной фор-мы открытый капиллярный сосуд заданного объема, прикрепленный к концу стержня. Другой конец стержня служит рукояткой приспособления для разбавления жидкостиИзвестный способ приготовленйя серийных разведений заключается в следующем. Описанныйкапиллярный сосуд при работе заполняют титруемой жидкостью путем прикосновения стенкой этого сосуда к поверхности жидкости, имеющейся, на-,пример, в пробирке. При этом вследствие смачиваемости стенки капиллярного сосуда поверхностный слойжидкости, находящийся в пробирке,разрывается, и жидкость за счет капиллярности сосуда устремляется вего полость, заполняет ее и в дальнейшем удерживается поверхностнымнатяжением, в капиллярном сосуде.Серийныеразведения для микротитрования готовят, используя титровальную пластину с ячейками, дозировочную пипетку для разбавителя и приспособление для разбавления жидкости с капиллярным сосудом путем выполнения приемов с перечисленнымиэлементами в следующей последовательности: с помощью дозировочной пипетки разливают разбавитель в последовательный ряд ячеек титровальной пластины в объеме, равном объему титруемой жидкости, который удерживает капиллярный сосуд (например,в объеме 0,025 мп, что соответствует одной капле). Затем капиллярныйсосуд, зайолненный титруемой жидкостью опускают в первую ячейку ряда титровальной пластины, погружая капиллярный сосуд в имеющийся в ячейкеразбавитель, и сообщают капиллярно-. му сосуду посредством рукоятки приспособления для разбавления жидкости несколько вращательных движений, чтоприводит к смешиванию в ячейке титруемой жидкости с разбавителем. При этом получают разведение в соотноше.нии 1:2 как в той части жидкости, что находится в ячейке вне капилляр- ного сосуда, так и в той части жидкости, которая заполняет полость сосудакапиллярного. Затем извлекаюткапиллярный сосуд из первой ячейки, при этом он захватывает своей полостью за счет капиллярности половину объема разведения из первой ячейки, и погружают капиллярный сосуд в разбавитель во второй ячейке ряда, вращают капиллярный сосуд, получая в этой ячейке разведение 1:4. Повторяя последовательно цикл перечисленных приемов, готовят серийное разведение жидкости для микротитрования в ячейках титровальныхпластин. В дальнейшем для микротитрования к приготовленным описанным способом серийным разведениям добавляют необходимые компоненты, применяемые при микротитровании (например, антигены, диагностикумя и др.) Ц .Недостатком способа является то, что он позволяет готовить серийные разведения в емкостях в виде ячеектитровальных пластин и не позволяетготовить серийные разведения длямикротитрования на рабочей поверхнОсти любой формы, в том числе плоской без углублений, например на простых предметных стеклах, применяемых при микроскопии, что необходИ- мо для титрования методом серийныхразведений, например, в висячей капле.Цель изобретения - приготовление серийных разведений для микротитрования на рабочей поверхностилюбой формы, в том числе плоской без углублений.Поставленная цель достигаетсяпредлагаемым способом приготовлений серийных разведений для микротитрования смешиванием в требуемых соотношениях титруемой жидкости, содержащейся в открытом капиллярном со" суде, и разбавителя, подаваемого с помощью дозатора, причем отличительными особенностями способа является то, что смешивание титруемой жидкости с разбавителем осуществляют непосредственно на капиллярномсосуде путем внесения заданной дориразбавителя в полость капилляра, пе реполнля его, часть полученного разведения, переполняющую капилляр,наносят на рабочую поверхность титрования, и процесс повторяют необходимое число раз.Для приготовления разведений 5 при соотношениях титруемой жидкости и разбавителя 1:2, 1:4, 1:8,1:2 д (где и - целое число, не равноенулю)используют равные дозы титруемой жидкости и раэбавителя.10 Более детально операции, составляющие описываемый способ, могутбыть охарактеризованы следующим образом.Смешивают титруемую жидкость втребуемых соотношениях с разбавителем при помощи дозатора, напримердозировочной пипетки для подачиразбавителя, и приспособления дляразбавления жидкости с капиллярнымсосудом. Дозировочная пипетка дляподачи разбавителя имеет заполненный разбавителем выходной канал,оканчивающийсявыходным отверстием,через которое подают пипеткой разбавитель в заданном объеме (дозе).Приспособление для разбавления жидкости представляет собой стержень, сприкрепленйым к концу этого стержняоткрытым капиллярным сосудом заданного объема, т.е. сосудом, обладаю- ЗО щим способностью заполняться жидкостью за счет капиллярности и удерживать заполнившую его жидкость засчет капиллярности сосуда и поверхностного натяжения жидкости. Запол нившая капиллярный сосуд жидкостьв дальнейшем удерживается в нем засчет капиллярности и поверхностногонатяжения и после отдаления капиллярного сосуда от поверхности жидкости, имеющейся, например, в пробирке. Емкость капиллярного сосудапредставляет собой микрообъем (малым объемом до 0,025 мл), Капиллярный сосуд имеет форму аналогичнуюизвестному капиллярному сосуду приспособления для разбавления жидкости или представлен, например, простооткрытой полусферой со щелями, прикрепленной к стержню. Используемыеварианты капиллярного сосуда представляют собой открытый капиллярныйсосуд заданного объема, оба приведенных варианта капиллярного сосуда дают одинаковый эффект, не оказывая влияния на сущность предлагаемого способа. Для приготовления серийных разведений титруемой жидкости на заполненный титруемой жидкостью капиллярный сосуд наносят разбавитель в объеме, поданном дозиро- бО вочной пипеткой. При этом разбавитель в поданном объеме, слившись ститруемой жидкостью, удерживаемойкапиллярным сосудом, образует смесьэтих компонентов, представляющую соб 5 бой разведение титруемой жидкостис разбавителем, которое удерживаетсяна переполненном капиллярном сосуде. Одна часть этого разведения заполняет капиллярный сосуд, а другая часть, удерживаемая поверхностным натяжением жидкости, обволакивает капиллярный сосуд снаружи и переполняет его. При слиянии поданной дозы разбавителя с титруемой жидкостью, удерживаемой в капиллярном сосуде и заполняющей его, происходит взаимное смешивание компонентов. Получив разведение титруемой жидкости путем такого переполнения разбавлением капиллярного сосуда, избыток приготовленного разведения, т.е. переполняющую капиллярный сосуд часть разведения, равный объему поданной дозы разбавителя, наносят на рабочую поверхность для титрования любой формы, в том числе плоскую без углублений, например на поверхность простого предметного стекла, освобождая при этом капиллярный сосуд от переполняющей его расти разведения, обволакивающей капиллярный сосуд снаружи. Затем на освободившийся от избытка разведения капиллярный сосуд, заполнен- ный той частью разведения, которая осталась в нем после освобождения капиллярного сосуда от переполняющей .части разведения (оставшаяся В капиллярном сосуде часть разведения равна объему капиллярного сосуда, его емкости, и удерживается в нем за счет капиллярности сосуда и поверхностного натяжения жидкости), подают с помощью дозировочной пипетки очередную дозу разбавителя, равную объему разбавителя, поданного при первой (предыдущей) подаче, и нанеся эту дозу разбавителя на капиллярный сосуд, опять его переполняют. Приготовив очередное разведение также путем указанного переполнения капиллярного сосуда, часть этого разведения, переполняющую капиллярный сосуд, наносят на следующий свободный участок рабочей поверхности для титрования, освобождая капиллярный сосуд от переполняющей его части разведения. Затем подают . на капиллярный сосуд следующую дозу разбавителя, и, повторяя цикл пере численных приемов в указанной последовательности, готовят серийные разведения жидкости для микротитрования на рабочей поверхности любой форМю.На фиг.1 схематически представ- дена операция заполнения сывороткой капиллярного сосуда; на Фиг.2 - операция подачи физраствора на заполненный сывороткой капиллярный сосуд; на Фиг.З - начальный момент операции нанесения разведения сыворотки на рабочую поверхность для титрования; на фиг.4 - завершающий момент операции нанесения разведения на рабочую поверхность. для заполнения капиллярного сосуда 1 приспособления для разбавления жидкости 2, опускают это приспособление, например, в пробирку 3 и прикасаются стенкой капиллярного сосуда к поверхности 4 сыворотки 5,не погружая капиллярного сосуда вжидкость (прикасаются стенкой капиллярного сосуда к мениску). При этомвследствие смачиваемости капиллярного сосуда поверхностный слой, сыворотки разрывается, и сыворотка изпробирки устремляется в капиллярныйсосуд .и его заполняет. После заполнения сывороткой этЬт сосуд отводятот поверхности сыворотки. Заполнившая капиллярный сосуд сыворотка в,дальнейшем удерживается в этом сосуде за счет капиллярности и поверхностного натяжения жидкости.На заполненный сывороткой сосуд 20 затем подают физраствор.Для подачи Физраствора на заполненный сывороткой капиллярный сосуд (фиг.2) направляют выходное отверстие б выходной канал T дозирод вочной пипетки 8, заполненной физраствором, на капиллярный сосуд 1приспособления для разбавления жидкости 2, так как устанавливают дозировочную пипетку по отношению кприспособлению для разбавления жидкости в таком положении, чтобы выходной канал пипетки оказывался направленным (нацеленным) своим выходным отверстием на заполненный сывороткой капиллярный сосуд, размещенный напротив выходного отверстия пипетки. При этом расстояние 9 междуконцом выходного канала пипеткиконцом пипетки) и капиллярным сосудом подбирается достаточным для того,40 чтобы при имеющейся скорости вытекания физраствора из отверстия пипетки физраствор попадал на капиллярный сосуд и во всей поданной дозе т.е.в заданном объеме) оказался нанесенным на капиллярный сосуд, переполняя этот сосуд. При слиянии поДанного укаэанным образом Физраствора с сывороткой, заполняющей капиллярный сосуд,происходит взаимное смешивание .этих компонентов, и полученная в результатеэтого смесь представляет собой первое разведение сыворотки физраствором в серийном разведении. Одна часть данного разведения заполняет.капиллярный сосуд, а другая часть, равная объему поданной дозы физраствора, переполняет капиллярный сосуд. Эта, переполняющая капиллярный сосуд часть разведения 10 обволакивает капиллярфо ный сосуди удерживается снаружи этого сосуда за счет поверхностного натяжения жидкости, не прикасаясь к концу пипетки. После получения на капиллярном сосуде разведения тит 5 руемой сыворотки, переполняющуюкапиллярный сосуд часть разведения 10 (т.е. ту часть разведения, которая переполняет капиллярный сосуд и равна по объему поданной на капиллярный сосуд, дозе разбавителя - физраствора) наносят на рабочую поверхность для титрования, т.е. на поверхность стеклянной пластины.Для нанесения разведения сывороткина рабочую поверхность 11 (фиг.З) приближают переполненный разведением капиллярный сосуд 1 приспособления для разбавления жидкости 2 к рабочей поверхности для титрования, обеспечивая достаточный контакт (прикосновение, переполняющей капиллярный со- . суд части разведения 10 с рабочей по-верхностью. При этом капиллярный сосуд приближают до такого предела, когда сцепление между жидкостью (переполняющей сосуд) и рабочей поверхностью отказывается достаточным для. 20 того, чтобы переполняющая капиллярный сосуд часть разведения оторвалась от остальной части разведения, заполняющей капиллярный сосуд, при выполнении следующей (очередной) 25 операции, а именно при отдалении капиллярного сосуда от рабочей поверхности для титрования.При удалении капиллярного сосуда 1 приспособления для разбавления жидкости 2 от рабочей поверхности 11 (фиг.4) этот сосуд освобождается от переполняющей его части разведения 10, которая оторвавшись от разведения, заполняющего капиллярный ,сосуд, располагается в виде капли на рабочей поверхности для титрования. На этом завершается цикл операций приготовления первого разведения сыворотки.Для приготовления второго разве дения на капиллярный сосуд, освободившийся от переполняющей его части первого разведения сыворотки, но эа полненный оставшейся в нем частью разведения (удерживающейся в капил лярном сосуде за счет капиллярности и поверхностного натяжения, и равную объему этого сосуда), подают указанным образом очередную порцию физраствора в объеме, равном объему физраствора, поданного при первой подаче, опять переполняя капиллярный сосуд физраствором в поданной дозе. При слиянии этой второй фазы физраствора с разведением сыворотки, имеющимся в капиллярном сосуде, получают второе разведение сыворотки. Часть этого разведения в объеме, переполняющем капиллярный сосуд, наносят описанным образом на следующий свобо дный участок рабочей поверхности для 40 титрования путем приближения капиллярного сосуда к рабочей поверхносаи для титрования до требуемого предела. Затем капиллярный сосуд удаляют от рабочей поверхности, освобождая этим его от избытка разведения, которое в виде капли располагается на рабочей поверхности. На освободившийся от переполняющей его части второго разведения капиллярный сосуд подают дозировочной пипеткой в укаэанном объеме (дозе) очередную порцию физраствора, и, повторяя цикл перечисленных приемов, готовят серийные разведения сыворотки для микротитрования на плоской рабочей поверхности стеклянных пластинПредлагаемый способ приготовления серийных разведений для микротитрования быв использован для постановки реакцйи агглютинации, которая включила приготовление серийных разведений иммунных сывороток лабораторных животных (морских свинок) для микротитрования на плоской рабочей поверхности, представленной поверхностью стеклянной пластины.П р и м е р. Для приготовления серийных разведений с помощью предлагаемого способа смешивают титруемую жидкость, в данном конкретном случае смешивают сыворотку крови иммунных животных в дальшейшем в тексте употребляется термин "сыворотка") в требуемых соотношениях с разбавителем, которым служил физиологический раствор (0,85-ный раствор хлорида натрия - далее в тексте "физраствор") при помощи дозировочной пипетки для подачи физраствора и приспособления для разбавления жидкости с капиллярным сосудом. При подаче пипеткой физраствор вытекал через ее выходное отверстие. Эта пипетка может быть также охарактеризована более широко как простейший дозатор разбавителя, имеющий выходное отверстие для подачи через данное отверстие разбавителя в заданной дозе. Приспособление для разбавления жидкости было представлено стержнем с прикрепленным к его концу капиллярным сосудом, т.е. открытым сосудом, обладающим свойством заполняться жидкостью за счет капиллярности ,при соприкосновении стенки этого со. суда с поверхностью жидкости, имею.щейся, например, в пробирке.С целью приготовления серийных разведений для микротитрования при соотношениях сыворотки и физраствора, выраженных прогрессией 1:2, 1:4, 1:8, и т.д. физраствор подают на заполненный капиллярный сосуд при каждой подаче в объеме, равном объему этого сосуда, т.е. объему.сыворотки, которая удерживается в капиллярном сосуде при его заполнении за счет капиллярности и поверхностного натяжения. При первой подаче физраствора получают первое разведение сыворотки в пропорции 1:2, при второй подаче физраствора первое разведение разбавляют вдвое, получая раз:3 2. Способю щ и й с яготовления раниях титруемоля 1:2, 1:4,число, не равравные дозы тразбавителя. по и 1 О ттем, что, с зведений прИсточники принятые во вним1. Инструкция титратор системы ".Лабор". Будапеш инфор ние п к апп Такач197:3 ведение сыворотки в пропорции 1:4. При последующей подаче физраствора получают разведения. 1:8, 1:6 и т.д.К приготовленным указанным образом серийным разведениям сыворотки добавляют при постановке реакции агглютинации антиген из риккетсий Провачека (использовался коммерческий препарат Львовского предприятия по производству бакпрепаратов). В параллельной серии опытов ставят реакцию агглютинации с этими же сыворотками и антигеном при приготовлении серийных разведений с помощью известного способа. Результаты реакции учитывают по высоте разведений сыворотки, т.е. по высоте титров, дающих агглютинацию.Всего в параллельных опытах было исследовано 16 сывороток.В таблице приведены результаты исследования сывороток в реакции агглютинации. Высота титров реакции агглютинации при приготовлении серийных разведений Представленные в таблице данные показывают, что результаты исследования сывороток в реакции агглютинации при приготовлении серийных разведений с помощью предлагаемого спосбба и микротитратора системы Такачи практически однозначны. Отмеченные кОлебания в пределах одного разведения представляют собой обычное явление, неизменно наблюдаемое при сопоставительном анализе результатов разного рода серологических реакций, в том числе и реакции агглютинации.Технико-экономическая эффективность изобретения заключается в том, что предлагаемый способ позволяет готовить серийные разведения для микротитрования на плоской поверхности, Предлагаемый способ можетбыть также использован для приготовления серийных разведений на рабочей поверхности для титрования и любой.другой формы, например, на поверхности, имеющей .углубления разногопрофиля и т.п. Формула изобретения 1, Способ приготовления серийных разведений для микротитрования смешиванием в требуемых соотношениях титруемой жидкости, содержащейся в открытом капиллярном сосуде, и ра бавителя, подаваемого с помощью д затора, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью приготовления серийных разведений на рабочей поверхности любой формы, в том числе плоской, без углублений, смешивание осуществляют непосредственно на капиллярном сосуде путем внесения заданной дозы разбавителя в полость капилляра, переполняя его, часть по лученного разведения, переполняющую капилляр, наносят на рабочую поверх ность титрования и процесс повторяют. необходимое число раз. личацелью прии соотношежидкости и разбавите 8, 1:2" (и - целое е нулю), используют руемой жидкости и.Парфенова Техред М,Рейвес ректор И.Муска Редак Заказ 5934/47 . Тираж 887ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва,Ж, Раушская наб., д.4/ дписн г.ужгород, ул.Проектная,4 Фнлиап ППП