Способ регенерации растенийлюцерны

сесоюзный аучно-исс ена Трудового Красного Знаменивательский институт кормов им(71) Заявитель 54) СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИИ ЛЮЦЕРНЫЯ ЧТВО Изобретение относится к сельско;,му хозяйству и может быть испольэовано в селекции и семеноводстве, вчастности для .соматической гибридизации, клеточной селекции, ускоренного размножения растений в исследованиях по фитопатологии, физиологии и генетике растений.Известен способ Ферментативноговыделения изолированных протопластов растений из клеток суспензионных культур, в частности сои, арахиса, фасоли (1).Однако получить растения-регенеранты из таких протопластов до сихпор не удавалось,Наиболее близким к изобретениюявляется способ регенерации растенийлюцерны из протопластов, выделенныхс помощью ферментов из каллусов листового происхождения 2),Однако этот способ применим толь"ко для растений, у которых листовыеэксплантаты образуют крупные, рыхлые каллусы, пригодные для мацерациив растворе ферментов. Частота такихрастений среди различных сортов игибридов люцерны колеблется в пределах 10-30, Таким образом, этот способ имеет лишь ограниченное приме" нение. Минимальный срок, необходимый,для получения Регенерантов этим спо-собом, довольно продолжителен и составляет 5 мес.,а выход регенерантовв расчете на 1 каллус незначителен(в среднем получают 3 растения на 1каллус),Целью изобретения является ускорение процесса регенерации растенийи повышение его эффективности.Поставленная цель достигается тем,что листочки, то есть пластинки тройчатого .листа, культивируемых сортови гибридов люцерны стерилизуют в0,1-ном водном растворе диоцида ипосле трехкратной промывки в стерильной дистиллированной воде делают накаждом из них ряд надрезов по всейплощади пластинки и помещают на основную питательную среду ГамборгаВ 6 (3),которую дополнительно вводят6000-8000 мг/л бактоагара и 200300 мг/л нитрата аммония, содержаниежелеза сернокислого (РеБО, 7 НО) увеличивают до 70-100 мг/л, трилона Б(ВаЭОТА) до 25000-35000 мг/л и вносят следующие Фитогормоныг 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д)- 816 мг/л, кинетин - 6-10 мг/л и Онафтилуксусную кислоту (НУК) - 0,1852275 100 в закрытых, прозрачных сосудах.В случае появления на листочкахбактериальной или грибной инфекцииих удаляют с частью прилегающей к 5 ним питательной среды. Состав среды В приведен в табл,1,Т а б л и ц а 1 Количество микроэлементамг/л ВитаминКоличество макроэлемента,мг/л Количество витаминамг/л Макроэлемент Микроэлемент 2500 Мпяа, Н О Никотиноваякислота 150 Ман РО 4. Н О(ын ) БО 4М 9804 7 Н 0 Еп 80 7 Н 0 На МО 04 2 НОСц 804. 5 НО СОС 66 НО 134 Тиамин-НСФ 10 250 0,25 Мисинозит0,025 100 Трилон Б (На ЭЭТА) 37 0,75 КЛ Примечание: Сахаровы 20000 мг/л, рн 5,5,Через 10-16 дней развившиеся каллусы переносят в жидкую среду В 5,содержание сахаровы в которой увеличивают до 25000-35000 мг/л и дополнительно вводят Фитогормон - бензиламинопурин (БАП) 0,2-0,8 мг/л, Материал инкубируют 6-8 дней в закрытыхпрозрачных сосудах на встряхивающихаппаратах с числом оборотов 100- 40125 мин" при тех же параметрах освещенности, температуры и влажности,которые используют при инкубациилисточков,Образовавшиеся через 6-8 днейсуспензии клеток используют для выде.ления изолированных протопластовили субкультивируют путем добавленияк 1 объему свежей среды того же состава 1 объема суспензии и через 68 дней инкубации повторно используютдля получения протопластов.Предназначенную для выделенияпротопластов суспензию клеток центрифугируют (4-5 мин, 135-160 с ипосле удаления супернатанта (надосадочная жидкость) добавляют к остав"шимся в осадке клеткам Раствор Ферментов с осмотиком, содержащий,вес.В:Целлюлаза 4,.0-5,0Пектиназа 3,0-3,5 . ЩКлористый кальций(СаСВ 6 НдО) 5,0-5,5Вода ОстальноеМатериал инкубируют в темнотепри температуре 26-1 С в теченйе 12-, д 14 ч, Выделившиеся протопласты отделяют от грубых примесей путем Фильтрования через сетку с диаметром пор 100-125 мкм, а затем отМывают от раствора ферментов четырехкратным центрифугированием (4-5 мин, 135- 160 д), используя для промывки 5,0- 5,5%-ный раствор хлористого кальция (СаС 6. 6 Н 20). После центрифугирования и удаления супернатанта к изолированным протопластам добавляют жидкую среду Гамборга В, содержание сахароэы в которой увеличивают до 25000-35000 мг/л, дополнительно вводят осмотик - Р-маннит - 85000- 95000 мг/л и Фитогормоны: ауксин (2,4-Р) из расчета 0,5-2,0 мг/л и цитокинин - БАП - 0,5-1,0 мг/л или кинетин - 1,0-2,0 мг/л, а РН среды доводят до 6,0.Образовавшуюся суспензию прото- пластов для окончательной очистки .От примесей Фильтруют через фильтр с диаметром пор 80-90 мкм ч инкубируют в закрытых прозрачных сосудах 18-24 ч в темноте, а затем при непрерывном люминесцентном освещении (400- 600 лк), температуре 26 х 1 С и относительной влажности воздуха 95-100,В течение инкубационного периода (24-30 дней) добавляют свежую питательную среду того же состава, но без осмотикаи фитогормонов, в которую дополнительно вводят амннокис 0,5 мг/л, а РН среды доводят до 5 ф 8- 6,0.Материал инкубируют 10-16 дней при непрерывном освещении люминесцентными лампами (освещенность ,5- 4,0 тыс.лк),температуре 26-1 С и относительной влажности воздуха 95 СаСЕ. 2 НО 150Реяо 4 7 Н о . 28 0,25 Пиридоксин-НСВ 1лоту-Ь-аспарагин иэ расчета 1200- , 1500 мг/л. Среду добавляют 5-7 раэ ,впервые через 6-7 дней после высева протопластов,а затем с интервалом 3- 4 дня иэ расчета 1 объем свежей среды на 8-10 объемов суспенэни. 5После образования из протопластов многоклеточных колоний (более 32 клеток в каждой) их переносят в свежую среду В, в которой содержание сахарозы увеличивают до 60000-80000 мг/л, добавляют 1 -аспарагин-750 мг/л и фитогормоны- (2,4-Д)-1, 5-2,0 мг/л и кинетин - 1,5-2,0 мг/л. Пересадку осуществляют путем добавления к 4-6 объемам свежей среды 1 объема суспензии с колониями. Материал инкубируют 18-24 ч при тех же параметрах, что и протопласты, а затем переносят на встряхивающие аппараты с числом оборотов 25-35 мин-(,освещенность повышают до 2000-2500 лк, другие парамет ры оставляют без изменений.Через 10-15 дней многоклеточные колонии образуют каллусы, которые пересаживают в свежую среду того же состава, при этом ссдержание сахаро зы снижают до 40000-60000 мг/л, а в качестве фитогормона используют один бенэиламинопурин в концентрации 0,2- 0,8 мг/л. Перееадку осуществляют путем добавления к 4-6 объемам свежей , среды 1 объема суспензии с каллусами, Материал инкубируют в закрытых прозрачных сосудах на встряхивающих аппаратах с числом оборотов 100- 125 мин -", освещенность повышают до 3000-4000 лк, температуру и относительную влажность воздуха оставляют беэ изменений.Через 10-12 дней на каллусах обра-зуются мелкие (200-500 мкм), зеленые эмбриоиды, которые пересаживают на ф) свежую среду того же состава, но без Ь-аспарагина, содержание сахароэы снижают до 30000-40000 мг/л. Пересадку осуществляют путем добав" ления к 4-6 объемам свежей средй 1 4 объема суспенэии с эмбриоидами, МатеВлияние возраста суспензионных культур клеток, состава и концентрации Фитогормонов в питательной среде на выход жизнеспособных изолированных протопластов приведены в табл,2,риал инкубируют при тех же параметрах,что и каллусы,Через 10-12 дней развиваются крупные (1,0-2,5 мм) зеленые эмбриоиды,которые пересаживают на агаризованную среду В (6000-8000 мг/л бактоагара) беэ гормонов н добавок. Ус-.ловия инкубации остаются прежними,но длину фотопернода сокращают до16 ч в сутки.1Через 15-20 дней развиваются проростки, которые пересаживают на агаризованную среду В 5 с разбавленной(1 г 2 - 1;3) концентрацией всех входящих в нее компонентов и инкубируютпри тех же условиях. По мере развития растений на этой среде и появле"ния у них 2-3 тройчатых листьев икорней (через 20-30 дней) их пересаживают в почву и выращивают в обычных,условиях.Работу, связанную со стерилизацией листьев получением протопластов и пересадками, проводят в асептических условиях,"П р.и м е р, Проводилась регенерация растений иэ протопластов, выделенных из клеток суспензионнйх культур люцерны. гибридной сортов Рамблер,Зайкевича и желтой сорта Дединовская.При этом получены следующие результаты: 95 листочков, помещенных на питательную среду с тремя Фитогормонами, через 14 дней образовали каллусы, которые помещали в жидкую питательную среду с 02 мг/л бенэиламинопурина из расчета 20 мг каллуснойткани на 1 мл среды и инкубировалина аппарате АВУ. (аппарат универсальный для встряхивания жидкостив колбах и пробирках) при 125 мини амплитуде колебаний 20-30 мм. Через 7 дней иэ каллусов образоваласьсуспензия клеток, содержащая в среднем 120 тыс. клеток в 1 мл. Полученную суспенэию после центрифугировання и удаления супернатанта испольэовали для выделения протопластов,добавляя к оставшимся в осадке клеткам раствор ферментов с осмотиком,содержащий,вес.Ъ целлюлазу ОпоэцМа Р=1500-4,0, пектиназу фЯегча, 5, хлористый кальций (СаС 6 Н О)5,5 и дистиллированную воду - 87 О,Раствор стерилизовали фильтрованиемчерез стеклянный фильтр 3 б 5 (ЯсноаЫ Сеп,3 епа, ПЭН), На 1 см эклетокоставшихся в осадке после центрифугиования, добавляли 1 мл ферментногораствора и инкубировали в чашках Петри в темноте при температуре 26-1 С.ь ов течение 13 ч. Выделившиеся протопласты отделяли от -рубых примесейпутем Фильтрования через трехслойнуюкапроновую сетку с диаметром пор125 мкм, а затем отмывали от раствора ферментов четырехкратным центрифугированием,(5 мин, 135-160 д), используя 5,5-ный раствор хлористогокальция (СаСВ 6 НО). К оставшимсяв осадке протопластам добавляли жидкую среду с О-маннитом и Фитогормонамиг 1) 2 4-0-0,5 мг/л + БАП1,0 мг/л 2) 2,4-0-2,0 мг/л + кинетин,0 мг/л и после фильтрованиясуспанэии через стеклянный фильтрПСвысевали в чашки Петри (по 23 мл в чашку размером 60 х 12 или60 х 15 мм). Конечная концентрацияпротопластов составляла 40-60протопластов составляла 40-60 тыс.в 1 мл) Количество протопластов из 1 мл клеточной сус-пенэии при концентрации фитогормонов, мг/л 1 ВАП,2 БАП 1,0 3,5 109,610 3,8 10+3,7 10+0,910 1-4 3,9 10+ 3,6 10 6-8 10-14 16-20 б 5 Таким обраэбм, оптимальный периодинкубации суспенэионных культур,предназначенных для выделения протопластов, составлял 6-8 дней. Наибольший выход жизнеспособных протопластов наблюдался при использовании вкачестве фитогормона бензиламинопурина в концентрации 0,2 мг/л. Изолированные протоцласты, полученные иэсуспенэионных культур, растущих всреде без фитогормонов, имели низкуюжизнеспособность и были непригодныдля культивирования.Значительное влияние на жизнеспособность протопластов н темп клеточных делений оказывала концентрацияфитогормонов в питательной среде,используемой для культивирования протопластов. Снижение концентрации фнтогормонов до 0,1-0,2 мг/л приводило к замедленному (на 2-3 нецели)развитию многоклеточных колоний икаллусов. Увеличение концентрациифитогормонов до 3-4 мг/л вызывалонарушения в процессе клеточных делений, ингибировало развитие многоклеточных колоний и каллусов. Оптюальные результаты были получены при использовании фитогормонов в концентрации 0,5-2,0 мг/л,В период образования из протопластов многоклеточных колоний (25дней) к инкубируемому материалу добав"ляли свежую среду, содержащую1350 мг/л Ъ-аспарагина. Первый разсреду добавляли через 7 дней послевысева протопластов, а затем с 34-дневным интервалом еще 4 раза.Финальная концентрация аспарагинав инкубационной среде составляла600 мг/л. 55 Добавление свежей среды с 3-4- дневными .интервалами повышало темп клеточных делений, что приводило к ускорению процесса развития много- клеточных колоний на 7-10 дней по сравнению с еженедельным добавлением среды. Уменьшение интервала между добавками до 1-2 дней приводило к повреждению части клеток, вследстБЪП,2+ кинетин - ф2,4-0 0,1 вие резкого снижения осмотическогодавления питательной среды,Образовавшиеся колонии пересажи-.вали в свежую среду, содержащую80000 мг/л сахарозы, 530 мг/л Ь-аспарагина, 2 мг/л 2,4-0 и 2 мг/л кинетина путем добавления к 1 объемусуспензии 4 объемов свежей среды иинкубировали 18 ч при тех же условиях, что и протопласты (с цельюстабилизации осмотического давления),а затем переносили инкубируемый материал на аппарат для встряхиванияс,круговым вращением ф С 81 ю=О=ЯЬа)е Е ТДВОВ и культивировалипри 30 мин-", освещенности 2100ЙОО лк и температуре 261 С. Увеличение числа оборотов до 40-50 мин 1приводило к повреждению колоний иих выбрасыванию на стенки чашек,снижение до 10-20 минуменьшалоаэрацию питательйой среды, в результате чего срок, необходимый для развития каллусов из многоклеточных колоний, удлинялся на 7-10 дней. Таким образом, оптимальное число оборотов составляло 25-35 мин- .Через 14 дней из многоклеточныхколоний образовались каллусы,которыепересаживали в свежую среду, содержащую 60000 мг/л сахароэы, 530 мг/л .Ь-аспарагина и 0,2 мг/л БАП (к 6объемам свежей среды добавляли 1объем суспензии с каллусами). Материал инкубировали на аппарате АВУ при 125 мин и освещенности 3500)200 лк до образования в суспенэиимелких, зеленых эмбриоидов (10 дней),Сусненэию с змбриоидами субкультнвировали путем добавления свежейсреды того же состава, но без аспарагина ( концентрацию сахароэй снижали до 40000 мг/л) и инкубировалив тех же условиях 10 дней.Значительное влияние на процессыразвития из протопластов многоклеточных колоний, каллусов и эмбриоидов оказывало введение в питательную среду аминокислоты - аспарагина,Добавление этого 1 соединения увеличивало число образовавшихся коло852275 10 Т а блица 3 Количество образованных в среднем на 50 тыс, высеянных протопластов Добавка впитательнуюсреду тканевых структур 200-500 мкм 8-16 клеточных 32 клеточныхколоний колоний 11625 16275 15485 16275 15485 АспарагинАргинин Контроль(без добавок) 9300 Добавление Ь-аспарагина стимулировало образование тканевых структур, из которых в дальнейшем развивались каллусы. При инкубации каллусов в питательной среде с аспарагином .чйсло образовавшихся эмбриоидов возрастало в 3 раза по сравнению с контрольным вариантом (среда без добанок). Полученные эмбриоиды нормально развивались в среде беэ аспарагина,Оптимальная концентрация Ь-аспарагина в инкубационной среде составляла 500-750 мг/л, Увеличение концентрации до 1000-1500 мг/л не повышало эффективность действия аспарагина, а уменьшение до 100-250 мг/л 40 приводило к замедленному (на 5-10 дней) образованию многоклеточных колоний, каллусов и эмбриоидов.Крупные, зеленые эмбриоиды.пересаживали на агаризованную среду В. без 45 гормонов, содержащую 30000 мг/л сахарозы и инкубировали при 16-часовом фотопериоде до образования проростков (17 дней), Проростки пересаживали на агариэованную среду В без гормонов с уменьшенной в 2 раза концентрацией всех компонентов. По мере развития иэ проростков растений с 2-3 листьями и корнями (20- 25 дней) их пересаживали в почву и выращивали в обычных условиях. Рас" тения-регенеранты были свободны от фитопатогенной инфекции, нормально росли и развивались, цвели и завязывали семена от перекрестного опыления и самоопыления. Период регенерации (от протопласта до растения) составлял 95-100 дней. В расчете на 1 каллус было получено 300 растений.При высеве изолированных прото- пластов в питательную среду с двумя 65 формула изобретения 1. Способ регенерации растений люцерны 1 п чего, включающий получение каллусов и суспензий клеток с последующим выделением из них протопластон, и культивирование их в условиях, способствующих развитию многоклеточных:колоний, каллусов, почек, эмбриоидов и растений, о т - л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения процесса регенерации растений и повышения его эффективности, протопласты выделяют из клеток суспензионных культур через 6- 8 дней инкубации в среде с бензиламинонурином, изолированные протопласты инкубируют в жидкой питательной среде Гамборга В с фитогормонами с добавлением каждые 3-4 дня свежей среды с Ь-аспарагином, а образовавшиеся многоклеточные колонии пересаживают в свежую среду с фито- гормонами и Ь-аспарагином и иикубируют на встряхивающих атпчаратах с ний в 1,75 раза по сравнению с конт-.ролем (среда беэ добавок). В контрольном варианте развитие продолжалось лишь до образования 8-16 клеточных колоний, которые впоследствии бурели., Наряду с Ь-аспарагином,другая аминокислота - Ь-аргинин стимулировала образование многоклеточных колоний, однако для нормально 1 опрохождения процесса каллусогенеэабыло необходимо присутствие в питательной среде Ь-аспарагина. Влияние аминокислот на развитие колоний, тканевых структур и эмбриоидов приведено в табл,З. сочетаниями фитогормонов (2,4-П - 0,5 мг/л + БАП - 1,0 мг/л и 2,4-0- 2,0 мг/л + кинетин - 2,0 мг/л) и последующего культивирования в одинаковых условиях были получены аналогичные результаты.Использование изобретения позволит значительно ускорить процесс регенерации растений иэ протопластов и повысить его эффективность. Высокий выход регенерантов позволит использовать данный способ вклеточной селекции, для генетической модификации растений, соматической гибридизации, ускоренного размножения и оздоровления растений и т.д,852275 12 Составитель А,Мезенцев Техред А. Ач Корректор С.Шекмар Редактор Н.Потапова Заказ 5569/1 Тираж 700 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП Патент, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 числом оборотов 25-35 мин-. до образования каллусов, которые пересаживают в среду с бензиламинопурином и Ь-аспарагином и инкубируют до образования эмбриоидов с последующей пересадкой их на среды, способствующие регенерации растений.2. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что суспензионные культуры клеток, предназначенные для вселения протопластов инкубируют в среде, содержащей 0,2-0,8 мг/л бензиламинопурина.3, Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что изолированные протопласты инкубируют в среде, содержащей в качестве фитогормонов: ауксин - 2,4-Р - 0,5-2,0 мг/л, цитокинин-беызиламинопурин 0,5-1,0 мг/л или кинетин 1,6-2,0 и /л.1 4. Способ по п,1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что среда, используемая для добаВок в период образования из протопластов клеточных колоний, содержит 1200-1500 мг/л Ь-аспарагина,а средадля пересадок колоний и каллусов 500-750 мг/л. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 101. В.О. БсЬеп 3 с 0,С, ИИЙеЪгапйг,фСгор Яс 1 епоа, 1969, 9, 5, р, 629631.2, Авторское свидетельство СССРР 743647, кл. А 01 Н 3/00, 1978 (про 15 тотип),3. 0.6 апйогу е 1 а 6 ф Ехрег 1 тпепгабСеИ ИезеагсЬ, 50, 1, р, 151-158,1968.